膠原在大鼠中成功誘導關節炎方案（CIA）

膠原在大鼠中成功誘導關(guan) 節炎方案（CIA）

膠原誘導關(guan) 節炎（CIA）應用是用Ⅱ型膠原免疫Wistar(遠親(qin) 雜交)、Sprague-Dawley (遠親(qin) 雜交)和Wistar-Lewis (近交) 中誘導成功。由於(yu) 此CIA模型具有與(yu) 人風濕病關(guan) 節炎（RA）相同的免疫和病理特征，因此該模型先後擴展到小鼠及非人靈長類動物，並已作為(wei) 人類關(guan) 節炎研究的廣泛應用的模型。然而，對於(yu) CIA模型來說，不同種屬動物之間是有差異的。小鼠對CIA的敏感性與(yu) 主要組織相容性複合體(ti) （MHC）相關(guan) ，在小鼠品係中隻有DBA/1(H-2^q)和B10.RⅢ(H-2^r)兩(liang) 個(ge) 品係對CIA敏感。大鼠對CIA的敏感性也與(yu) MHC相關(guan) ，並與(yu) 小鼠相比具有較寬的品係範圍。因此，不同MHC型的不同品係的大鼠，盡管關(guan) 節炎的發病率、嚴(yan) 重程度及抗體(ti) 和T-cell 的特異性在不同品係間不同，但都能夠誘發關(guan) 節炎。

動物的管理與(yu) 飼養(yang)

動物必須是7-8 周齡健康的並在SPF條件下飼養(yang) 的動物。一般來說，對於(yu) 腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對抗原的免疫應答。無菌的大鼠對佐劑誘發的關(guan) 節炎高度易感（AIA），其次是SPF級大鼠及一般大鼠敏感性相對較低。即使同一品係,CIA 的發病率及嚴(yan)   重程度也有顯著差異，這種差異是由於(yu) 飼養(yang) 條件造成的。

   *，小鼠的飲食影響  CIA的發病率及嚴(yan) 重程度。然而在大鼠在中沒有進行廣泛研究。與(yu) 小鼠相比，大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答更快且較短時間內(nei) 能誘發關(guan) 節炎，因此飲食對小鼠來可能不是影響關(guan) 節炎的重要因素。然而，像小鼠一樣，飼以高脂肪的食物對誘發關(guan) 節炎更有利。

大鼠的品係

對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關(guan) 節炎的進展與(yu) MHCRT1位點相關(guan) 而且用於(yu) 免疫的Ⅱ型膠原的動物來源不同也會(hui) 造成大鼠對Ⅱ型膠原的免疫應答以及關(guan) 節炎的進展上的差異。然而，與(yu) 小鼠相比，很多品係的大鼠對CIA敏感，並能誘發一定程度的關(guan) 節炎。一般來說，豬的Ⅱ型膠原是的致炎膠原其後是牛的二型膠原，雞的二型膠原致炎性zui差。以下大鼠品係是已明確的對CIA高度易感的品係：BB/DR (RT1^u), Wistar Furth, LOU (RT1^u), OM (RT1^u)和 LEW (RT11) 大鼠。

  動物質量也很重要。在這方麵，腸道菌群可能是影響機體(ti) 對二型膠原免疫應答和關(guan) 節炎進展的重要影響因素之一。例如:Lewis 大鼠對CIA高度易感，同時發病率和炎症嚴(yan) 重程度都很高。但是同是SPF級Lewis 大鼠對CIA的敏感性由於(yu) 年齡、飼養(yang) 條件及免疫腸道菌而對CIA的敏感性存在顯著差異。MDP(胞壁酰二肽)對加強Lewis 大鼠對CIA的發病率和嚴(yan) 重程度非常有效。但是我們(men) 建議在用Lesis 大鼠造模之前先進行小規模試驗，據我們(men) 所知BB大鼠是用於(yu) CIA造模的品係。

DA大鼠對CIA的敏感，但是同時AIA（佐劑誘發的關(guan) 節炎）及礦物油誘發的關(guan) 節炎（僅(jin) 礦物油）高度敏感，因此不推薦用於(yu) CIA的造模。

 注1：與(yu) 小鼠相反大鼠對同源（大鼠）Ⅱ型膠原是敏感的，同時誘發和猴一樣的關(guan) 節炎。

 注2：與(yu) 小鼠和猴子相反，大鼠對Ⅱ型膠原抗體(ti) 是針對Ⅱ型膠原分子構象的特異性抗體(ti) 。因此膠原變性或免疫Ⅱ型膠原的單獨CB肽段都不能在大鼠中致炎。

膠原

因為(wei) 去糖基化的膠原會(hui) 影響關(guan) 節炎的產(chan) 生，同時一些未去除的雜質比如：胃蛋白酶可能會(hui) 導致T細胞刺激試驗中產(chan) 生假陽性，因此Ⅱ型膠原應按規定高度純化。如果按恰當的方法凍幹的膠原-20℃避光保存的條件下，是非常穩定的。純化的膠原溶於(yu) 0.05M濃度的醋酸中，終濃度為(wei) 2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過夜。膠原溶液在4℃保存一周，此後需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級別的Ⅱ型膠原。（見表1）

表1 不同種屬來源Ⅱ型膠原

乳劑的製備

1）由於(yu) 大鼠通常對佐劑誘發的關(guan) 節炎（AIA）是敏感的，因此必須使用不*佐劑（IFA）,貨號是7002。乳劑的質量是能否誘發關(guan) 節炎高發病率的關(guan) 鍵因素。乳劑的製備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導致乳劑不能夠有效的、穩定的誘發關(guan) 節炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個(ge) 片段，這些小片段在正常體(ti) 溫下，很容易變性。推薦使用電動的高速攪拌器：

用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，Fig.1）攪拌不*佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從(cong) 活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架台上，並冰浴。zui後一步很重要，因在攪拌過程中會(hui) 發熱，會(hui) 引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發關(guan) 節炎（CIA）。

   Fig1. 高速攪拌器Fig2  刀片，截斷的注射器，漢密爾頓玻璃注射器、

Fig. 截斷的注射器，支架上固定，冰浴

2）加1體(ti) 積（zui多2.5mL）不**佐劑到注射器，再加等體(ti) 積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

３）繼續混合，直到在zui大轉速產(chan) 生穩定的乳液（轉速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對於(yu) 大體(ti) 積（2-5Ml）為(wei) 了使乳液混合均勻，建議在混勻過程中移動攪拌位置。

 注：可能需重複攪拌2-3次

4)將一滴乳劑滴與(yu) 一燒杯水中，檢測乳劑的穩定性。如果乳劑是穩定的，在水中是成團的，不散開。

   注：如果乳劑在水麵散開，表明乳劑不穩定。再加幾滴佐劑，重新混合後，再檢測。

5）將乳劑轉移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因為(wei) 很難做到一個(ge) 準確的注射劑量。

注1：通過用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個(ge) 的注射劑量。

注2：建議在乳劑製備好的一小時內(nei) ，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

注射部位

在鼠尾根部注射0.2mL(膠原：200μg)乳劑（Fig.4）。例如：從(cong) 尾根部2cm處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與(yu) 鼠尾方向平行插入。如果要加強免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下據鼠尾根部1.5cm處。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1Ml）。

注2：無論如何，我們(men) 不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強免疫。因為(wei) 不*佐劑在腹膜和腹腔引起嚴(yan) 重的炎症反應。

圖4：皮下免疫乳劑

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體(ti) 水平及其亞(ya) 型（可激活補體(ti) ），對關(guan) 節炎的發生很重要。依據實驗目的有很多種方法可誘發高發病率的關(guan) 節炎。

1. 通過單次免疫（無加強免疫）誘發關節炎

 依據說明書(shu) 方法製備乳劑（膠原-不*佐劑）和免疫，由於(yu) 不同品係的的敏感性的差異，一般在2-3周可誘發關(guan) 節炎。在一些免疫應答較強的品係，發病率達到80-90%。對於(yu) 一些高度易感品係如BB大鼠，關(guan) 節炎嚴(yan) 重程度，臨(lin) 床評分可達到10-12分（zui高16分）。

b 通過加強免疫誘發關(guan) 節炎

  為(wei) 了確保關(guan) 節炎的發病率和嚴(yan) 重度，可在初次免疫7天後加強免疫。按說明書(shu) 方法，準備膠原-不*佐劑，尾部皮下注射0.1mL,會(hui) 短時間內(nei) 產(chan) 生嚴(yan) 重的關(guan) 節炎。

  按要求製備膠原+IFA 乳劑（1：1）

  初次免疫(0day) ：200 ul 乳劑/隻

  加強免疫（7day）：100ul 乳劑/隻

c 用人工合成的胞壁酰二肽作為(wei) 佐劑誘導關(guan) 節炎

  *弗氏佐劑含滅活的結核杆菌，不能和二型膠原合用免疫大鼠。但是，可以用另一種佐劑MDP(N-acetylmuramyl-alanyl-D-isoglutamine hydrate)  用於(yu) 免疫。用雙蒸水溶解MDP至4-8mg/ mL。 膠原溶解於(yu) 0.5M的醋酸中，終濃度為(wei) 4mg/ mL。免疫前等體(ti) 積混合MDP和膠原溶液。將MDP-膠原混合物和等體(ti) 積的IFA(不*佐劑)按上述方法混合。尾部皮下注射0.2 mL。與(yu) 僅(jin) 使用不*佐劑相比，這種方法在關(guan) 節炎的發病率、嚴(yan) 重性和一致性（實驗批間）都會(hui) 大大提高。

注：單獨使用高劑量（0.8mg/隻）的MDP也能誘發關(guan) 節炎。因此，建議依據不同品係，優(you) 化使用MDP劑量。不要在DA大鼠使用這種方法。

關(guan) 節炎的發生

於(yu) 小鼠相比（約4周），關(guan) 節炎在大鼠中產(chan) 生的更快，初次免疫後，2-3周出現關(guan) 節腫脹。在BB大鼠發生關(guan) 節炎的時間比其它品係更快，約12-14天。如果免疫有效，3周後100%發生關(guan) 節炎。

臨(lin) 床評分

關(guan) 節炎可通過臨(lin) 床評分來定性評估或用測厚儀(yi) 來測量爪子厚度來評估。這些方法適用於(yu) 所有的關(guan) 節炎模型比如經典的CIA，佐劑誘導的關(guan) 節炎和棉線誘導的關(guan) 節炎。

表2  關(guan) 節炎炎症程度的臨(lin) 床評分