Matrigel 使用指南及常見疑問

Matrigel 使用指南及常見疑問

Matrigel 收貨注意事項，請檢查：

1.       盒子內(nei) 是否有幹冰

2.       基質膠是否呈固態，膠麵是否水平

3.       基質膠顏色是否在正常範圍（黃色-粉紅-深紅）

產(chan) 品特性 ：

Martrigel基質會(hui) 有色差變化（淡黃色到深紅色），是由於(yu) 酚紅和碳酸氫鹽與(yu) CO2的作用引起的，但是與(yu) 5%CO2平衡後色差即會(hui) 減少。

基質膠凍融操作 ：

收貨後，若不立刻使用基質膠，應馬上將仍然是冷凍固態的基質膠放進-20℃冰箱保存。使用前須先將基質膠凍融。

凍融：

將基質膠埋於(yu) 鋪滿碎冰的冰盒中，然後將整冰盒放入4℃冰箱stay overnight溶解。（普通濃度的基質膠，溶解時間1-2天；高濃度基質膠溶解時間 3-7天）。

分裝：

溶解後的須分裝保存，以避免反複凍融。液態基質膠，會(hui) 在10℃以上快速成膠（特別是高濃度基質膠），因此，分裝時，接觸到基質膠的耗材必須預冷（如移液管、吸頭、EP管等），並且整個(ge) 實驗必須無菌、冰上操作。（高濃度的基質膠比較粘稠，用移液器不好吸取，可以使用去掉針頭的預冷注射器吸取。）

保存：

分裝後的基質膠在冰上應仍然呈現液態，此時將基質膠放進-20℃保存即可。進行實驗時，取出分裝好的小管，4℃凍融。若分裝好後基質膠已經凝固，說明分裝操作不能很好地保持低溫，導致基質膠已經成膠，不適宜使用。

普通濃度基質膠操作：

包被與(yu) 成膠

細胞可在0.5mm厚度的基質膠表麵生長，可以在1mm厚度的三維基質內(nei) 生長。過度稀釋的基質膠會(hui) 形成非膠質的蛋白層，可以用於(yu) 細胞貼壁，但不能用於(yu) 細胞的研究分化。為(wei) 保證基質膠的成膠性能與(yu) 穩定，稀釋濃度不應低於(yu) 1：3，可用預冷無血清培養(yang) 基稀釋，成膠後立即使用。

薄膠成膠方法：

1．凍融後，用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2．  將需要使用的培養(yang) 板置於(yu) 冰上，加入濃度為(wei) 50ul/cm2生長麵積的基質膠。

3．  在37℃放置30min，即可使用。

厚膠成膠方法

1.      凍融後，用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2.      將需要使用的培養(yang) 板置於(yu) 冰上，將培養(yang) 的細胞與(yu) 基質膠混合，用移液槍頭使其懸浮於(yu) 基質中。加入濃度為(wei) 150-200 ul/cm2生長麵積的基質膠。

在37℃放置30min，可成膠。也可以加入細胞培養(yang) 的基質，也可使細胞直接生長在膠表麵。

薄層包被方法：

1.     凍融後，用預冷的移液槍頭混勻基質膠成勻漿狀。

2.     根據需要，采用無血清培養(yang) 基稀釋基質膠，根據實驗需要確定*包被濃度。

3.     將稀釋的基質膠包被與(yu) 所需的培養(yang) 器皿中，包被量至少覆蓋整個(ge) 器皿的生長表麵，室溫下孵育1小時。

去除未結合的基質膠，用無血清培養(yang) 基輕輕地衝(chong) 洗。備注：普通濃度的基質膠，建議稀釋濃度不低於(yu) 3mg/ml；我們(men) 不能保證稀釋濃度低於(yu) 3mg/ml能夠成膠。

普通濃度的基質膠，不建議用於(yu) 成瘤實驗。

BD細胞回收劑354253，離散酶354235，冰浴7小時後回收得到細胞。

腫瘤侵襲實驗：

操作過程

1.     凍融（對於(yu) 預包被的24孔培養(yang) 小室請參考1.1-1.3操作，對於(yu) 自己包被好待用的24孔小室，請直接從(cong) 步驟2開始）

1.1  從(cong) -20℃冰箱中取出產(chan) 品，使其自然升溫到室溫。

1.2  取出培養(yang) 板在細胞小室內(nei) 加入500μL 37℃預熱的PBS，37℃無CO2環境下孵育2小時。

1.3  解凍後，小心去除小室內(nei) 的培養(yang) 基，避免破壞Matrigel基質膜。

2.     染色劑後標記法

細胞通過侵襲消化基質膜後遷移到下小室，采用熒光標記定量細胞。細胞的侵襲能力用終點計算法計算得到。對於(yu) 采用實時動力曲線的計算，推薦使用前標記法。

2.1 如步驟1 準備培養(yang) 板。

2.2 胰酶消化細胞單層後製得細胞懸液，溶於(yu) 無血清DMEM培養(yang) 基，推薦濃度為(wei) 5×10⁴cells/mL。

2.3 上小室中加入500μL細胞懸液（2×10⁴ cells）。

2.4 通過進樣口在下小室中加入750μL誘導劑。

2.5 在37℃，5% CO2 條件下孵育培養(yang) 板和對照板20-22小時（由細胞類型決(jue) 定）。

2.6 孵育後，小心去除上小室中的培養(yang) 基及基質膠，避免破壞小室的膜及膜底侵襲轉移的細胞。

2.7 將培養(yang) 小室轉移到另一塊24孔板中，結晶紫或鈣黃綠素染色。計算。