Biocoat 血管生成係統：內皮細胞侵襲

Biocoat 血管生成係統：內(nei) 皮細胞侵襲

BD 產(chan) 品貨號：354141、354145、354146

儲(chu) 存和運輸：-20度儲(chu) 存，幹冰運輸。

操作指南：

血管生成過程中，內(nei) 皮細胞活化後表達基質蛋白酶（MMPs），可降解血管基底膜。BD Biocoat 內(nei) 皮細胞侵襲係統提供了抗/促血管再生化合物的體(ti) 外定量實驗模型。內(nei) 皮細胞侵襲係統包括：BD Falcon24多孔培養(yang) 小室，含配套接收板和蓋子；BD fluoroBlok熒光屏蔽3.0μm孔徑PET膜，預包被Matrigel基質，具體(ti) 操作步驟如下：

1 凍融

1.1 從(cong) -20℃冰箱中取出包裝，使其自然升溫到室溫。

1.2 在小室內(nei) 加入0.5ml37℃預熱的基本培養(yang) 基，在37℃CO₂環境下凍融15-45分鍾，待用。

1.3 凍融後，小心去去除培養(yang) 基，避免破壞Matrigel基質膜。可用抽吸或倒置培養(yang) 板並輕拍的方法去除培養(yang) 基。

2 侵襲實驗：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑後標記

細胞侵襲基質膜穿過熒光標記膜後，采用熒光標記定量。

2.1 采用如1.1的步驟凍融，對照板無需凍融。

2.2 胰酶酶解細胞單層，使其懸浮在無血清培養(yang) 基中，濃度為(wei) 2.0×10⁵/mL。*的接種細胞濃度需要采用一係列細胞濃度進行優(you) 化，包括在下室培養(yang) 表麵的濃度（例如，培養(yang) 瓶，培養(yang) 皿和培養(yang) 板）。例如，接種濃度為(wei) 10⁵cell/cm²時，采用濃度為(wei) 0.5×10⁵到5.0×10⁵ cell/cm²的範圍確定*的接種濃度。

2.3 在上小室中加入0.25mL的細胞懸浮液（5.0×10⁴ cell/well）。

2.4 通過進樣口，快速加入750μl含5%FBS或適量生長因子（比如BDVEGF）的培養(yang) 基，作為(wei) 底部小室的化學誘導劑。

2.5 小室和對照小室在37℃，5%CO₂環境下培養(yang) 22±1小時。

3、細胞侵襲能力的測定：用BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑後標記定量

注意：對於(yu) 每一個(ge) 完成得培養(yang) 板，需要12.5mL的HBSS和50μg的鈣黃綠素。HBSS的使用時為(wei) 了減少熒光染色劑自動水解引起的高背景熒光。

3.1 準備濃度為(wei) 4μg/mLd 高黃綠素。12.5mL的HBSS37℃預熱。50μg高黃綠素用20μLDMSO溶解，加入150μL預熱的HBSS。將其轉入大量的HBSS中，用150μL預熱的HBSS清洗熒光染料的容器。

3.2 孵育後，小心去除上小室中的培養(yang) 基。注意小心轉移鄰近小室底部的培養(yang) 基。可以通知抓住培養(yang) 板，輕輕拍打，使培養(yang) 基從(cong) 下部滴落。避免破壞Matrigel基質膜。

3.3 將培養(yang) 小室轉移到另一塊24孔板中，該孔板含有0.5mL每孔的4μg/mL鈣黃綠素。在37℃，5%CO₂環境下孵育90分鍾。

3.4 侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數取得，激發波長494nm，發射波長517nm。隻有侵襲並通過Matrigel FluoroBlok^TM膜後細胞才能被檢測。

注意：後標記所使用的染色劑不局限於(yu) 胞核染色，比如SYTO-24，在血清培養(yang) 基環境中具有較低背景，不需要使用第二塊板用於(yu) 標記。

4、侵襲研究：DilC12（3）熒光染色劑預標記法

細胞接種於(yu) 孔板之前先用於(yu) 染色劑標記，可用於(yu) 均一化實驗，所得到的實時動力曲線可揭示細胞通過基底膜侵襲的能力，不需要分解和破壞各個(ge) 時間點。

4.1 如1.1所示凍融。

4.2 不同濃度的各類熒光素對細胞標記的程度不同，標記濃度和時間，接種細胞濃度和化學誘導劑必須先優(you) 化。

4.3 胰酶消化細胞單層，製備細胞懸液，溶於(yu) 無血清DMEM培養(yang) 基，濃度為(wei) 2×10⁵cell/mL。*的接種細胞濃度需要采用一係列細胞濃度進行優(you) 化，包括在下室培養(yang) 表麵的濃度（例如，培養(yang) 瓶，培養(yang) 皿和培養(yang) 板）。例如，接種濃度為(wei) 10⁵cell/cm²時，采用濃度為(wei) 0.5×10⁵到5×10⁵ cell/cm²的範圍確定*的接種濃度。

4.4 在上小室中加入0.25mL的細胞懸液（5.0×10⁴cell/小室）。

4.5 通過進樣口，快速加入750μL含有5%FBS或適量生長因子（如BD VEGF）的培養(yang) 基，作為(wei) 下室的誘導劑。

4.6 小室和對照小室在37℃，5%CO₂環境下培養(yang) 22±1小時。

5、細胞侵襲的計算：用DilC12（3）熒光染色劑後標記定量

侵襲小室的熒光定量信息通過熒光板讀板機底部讀數取得，激發波長549nm，發射波長565nm。隻有侵襲通過Matrigel FluoroBlok膜被標記的細胞才能被檢測。

6、結果計算

注意：數據可以用相對熒光值RFU或侵襲百分比表示，後者在標準化數據處理中更有用。

背景扣除：計算平均背景值，將其從(cong) 各個(ge) 孔板中扣除。

6.1 侵襲百分比

侵襲百分比%=通過基質膜包被的熒光膜侵襲細胞的平均相對熒光值/通過未包被熒光膜侵襲的平均相對熒光值×100

6.2 信噪比

信噪比S/N=實驗組細胞侵襲的相對熒光值/對照組細胞侵襲的相對熒光值

自動化操作注意事項

1 BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yang) 小室係統能適用於(yu) 自動化操作係統。蓋子可以用標準機械手取走，也可用吸力取走。

2 為(wei) 了避免各孔間汙染，孔板設定為(wei) 一個(ge) 統一的方向。為(wei) 了與(yu) 培養(yang) 小室匹配，確保Falcon的商標均在2者上方，麵向同一個(ge) 方向。

3 任何規格的槍頭都能達到小室的兩(liang) 邊。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。