石蠟切片免疫組化染色步驟

1、載玻片的處理： 抗原修複過程中，由於(yu) 高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為(wei) 保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體(ti) 方法如下： 1.1 APES：現用現配。將洗淨的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鍾，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾幹即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，並盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。 1.2 HistogripTM：將洗淨的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鍾，然後用雙蒸水快速清洗三次，室溫幹燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。 1.3 Poly-L-Lysine：將洗淨、幹燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鍾，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜幹燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為(wei) 非玻璃製品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為(wei) 0.05%~0.1%，消化時間為(wei) 37℃、10~40分鍾，主要用於(yu) 細胞內(nei) 抗原的顯示。2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為(wei) 0.4%，消化時間為(wei) 37℃、30~180分鍾，主要用於(yu) 細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。 2.3 g/ml的saponin溶液，消化時間為(wei) 室溫孵育30分鍾。m皂素（Saponin）：一般使用濃度為(wei) 2~103、抗原熱修複： 可根據實驗室的具體(ti) 條件，選用微波爐抗原修複、高壓鍋抗原修複或水浴高溫抗原修複。抗原熱修複可選用各種緩衝(chong) 液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（pH6.0）效果。請選用我公司提供的ZLI-9064  0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。±枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於(yu) 1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 3.1 石蠟切片微波爐抗原修複操作方法：切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（工作液）的容器中，置微波爐內(nei) 加熱使容器內(nei) 液體(ti) 溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體(ti) 機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從(cong) 緩衝(chong) 液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢複原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。 3.2 石蠟切片高壓抗原修複操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（工作液）注入不鏽鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於(yu) 金屬架上，放入鍋內(nei) ，使切片位於(yu) 液麵以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後），計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源，冷水衝(chong) 至室溫後，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。 3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修複操作方法：切片脫蠟至水後，放入盛有枸櫞酸鹽緩衝(chong) 液（工作液）的容器中，並將此容器置於(yu) 盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從(cong) 小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水衝(chong) 洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。