ELI-SPOT 及其應用

一、            原理 ELI-SPOT，即斑點ELISA，是利用酶標板作反應容器進行的酶聯免疫反應。其基本原理與(yu) ELISA相同。首先用捕獲抗體(ti) 包被反應板，封閉後，依次加入待檢標本、生物素化檢測抗體(ti) 、鏈黴菌抗生物素蛋白-堿性磷酸酶及底物，陽性結果出現斑點顯色，利用倒置顯微鏡進行斑點計數。其優(you) 勢在於(yu) 可在與(yu) 體(ti) 內(nei) （活體(ti) 條件）極接近的條件下，在體(ti) 外對細胞分泌成分（如細胞因子、Fas等）進行追蹤研究。 幾點說明： l        反應板：ELI-SPOT所用的反應板可以是PVDF膜包被好的，也可以是普通酶標板。如用普通酶標板，需用特製的瓊脂糖底物溶液。因此，ELI-SPOT又可分為(wei) PVDF法和瓊脂糖法。 l        待檢標本須製成單細胞懸液，細胞經適當誘導劑刺激後產(chan) 生相應的因子。 l        細胞誘導方法：細胞誘導可分為(wei) 直接法和間接法。如果細胞誘導過程是在抗體(ti) 包被的反應孔內(nei) 進行的，即為(wei) 直接法；如果細胞誘導過程是在24孔板或燒杯中進行的，即為(wei) 間接法。采用直接法還是間接法取決(jue) 於(yu) 以下幾個(ge) 方麵：待分析細胞的類型。‚預期的能分泌細胞因子的細胞數。如果預期的可分泌細胞因子的細胞量少，建議使用直接法；如果可分泌細胞因子的細胞量特別高，用間接法。 l        誘導劑及誘導時間的選擇：與(yu) 待檢因子種類相關(guan) ，參照下表（廠家提供，僅(jin) 供參考） 待檢因子 樣本來源 誘導劑 誘導時間 檢測用細胞量 Human IL-2 PBMC PMA, Ionomycin 10-15 hours 5x104-1x105 Human IL-4 CD4+ T細胞 PMA, Ionomycin 10-15 hours 2x105-2.5x105 Human IL-6 PBMC LPS 10-15 hours 1x104-2.5x104 Human IL-10 PBMC LPS 20-24 hours 2x105-2.5x105 Human IL-12 PBMC LPS Overnight 1x105-2.5x105 Human IFN-γ PBMC PMA, Ionomycin 10-15 hours 2x104-5x104 Human TNF-α PBMC LPS 10-15 hours 2x104-4x104 Human Fas L PBMC Anti-human CD3 （B-B11）, IL-2, / PMA,Ionomycin 3days,10-15 hours 3x105-4x105 Murine IFN-γ PBMC PMA, Ionomycin 10-15 hours 2x104-5x104 Rat IFN-γ PBMC PMA, Ionomycin 10-15 hours 2x104-5x104 Rat TNF-α Rat splenocyte LPS 10-15 hours 2x104-4x104   二、            ELI-SPOT 操作步驟 A：PVDF法 1． 96孔PVDF包被板經70%已醇處理後，用捕獲抗體(ti) 進行包被。 2． 單細胞懸液（含適當誘導劑）加入反應孔內(nei) ，孵育（直接法）；如用間接法，細胞在24孔板或燒杯中誘導後，取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內(nei) 。 3． 倒掉細胞，加入生物素化檢測抗體(ti) ，孵育。 4． 加鏈黴菌抗生物素蛋白堿磷酶。 5． 加入BCIP/NBT底物，形成斑點。 B：瓊脂糖法 1． 用捕獲抗體(ti) 包被酶標板。 2． 單細胞懸液（含適當誘導劑）加入反應孔內(nei) ，孵育（直接法）。如用間接法，細胞在24孔板或燒杯中誘導後，取適量誘導過的細胞懸液加入到反應孔內(nei) 。 3． 倒掉細胞，加入生物素化檢測抗體(ti) ，孵育。 4． 鏈黴菌抗生物素蛋白堿磷酶。 5． 加入瓊脂糖底物溶液，形成斑點。   三、            ELI-SPOT 檢測單細胞分泌細胞因子的意義(yi) 細胞因子是一類由白細胞和其它一些細胞產(chan) 生的，可在細胞間進行信息傳(chuan) 遞。大多數細胞因子是生長或分化調節因子，通常在造血係統中發揮作用，同時發現其在腦、肌肉和內(nei) 分泌器官間也存在相互作用，另外，還能誘導細胞凋亡。在一些疾病中，如急性炎症、血液病、癌症和自身免疫性疾病中可常見細胞因子的異常表達。 在單細胞水平進行細胞因子的監測提供了zui接近“原位”環境的，即zui接近體(ti) 內(nei) 條件，觀察細胞因子產(chan) 生的方法。這正是ELI-SPOT方法的特性。它可使科研工作者在體(ti) 外進行與(yu) 體(ti) 內(nei) 環境相似的研究。利用這一方法，可跟蹤細胞因子的產(chan) 生、跟蹤疾病進展、調整臨(lin) 床治療策略、防止病情惡化以及致命後果的發生。   四、            ELI-SPOT應用 1． 在自身免疫腦脊髓炎疾病研究中，給大鼠注射幹擾素β後，可顯著隆低可產(chan) 生幹擾素γ的細胞的數量。（1） 2． 進行免疫基因肽疫苗的評價(jia) 。（2） 3． 接種途徑效果的評估。（3） 4． 研究TH1/TH2 T細胞產(chan) 生細胞因子的方式以及由一個(ge) 亞(ya) 群向另一個(ge) 亞(ya) 群轉換的情況。（4，5） 5． 成功檢測黑色素瘤中腫瘤活性T細胞數量。（6） 6． 用於(yu) 重症肌無力患者外周血IFN-γ、IL-10分泌性T細胞的研究。（7）   五、            參考文獻： 1． Ruuls, S.R. et al., 1996  J. Immunol. 157:5721 2． Kulane, A. et al., 1997  Acta Tropica. 68:37 3． Ibsen, M. W. et al., 1997  Scand. J. Immunol. 46:274 4． Gabrielsson, S. et al., 1997  Allergy. 52:860 5． Elaghazali, G. et al., 1997  Clin. Exp. Immunol. 109:84 6． Scheibenbogen, C. et al. 1997  Int. J. Cancer 71:932 7． 侯世芳，閆曉波，王維治，1999  第六屆全國神經免疫學術研討會(hui) 論文匯編