共焦鏡同時檢測細胞內Ca2+和pH的變化

中華物理學與(yu) 康複雜誌 1998年第1期第1卷 論著

作者：黃行許 鮑永耀 黃輝張薇 霍霞 樸英傑

單位：510515 *軍(jun) 大學中心實驗室

關(guan) 鍵詞：顯微鏡檢查,熒光/方法;巨噬細胞/生理學；鈣/分析；酸堿平衡；小鼠

　　摘　要　目的　細胞內(nei) 遊離Ca²⁺與(yu) 胞漿的pH在不同因素作用下可以改變。研究可以同時檢測遊離Ca²⁺與(yu) pH變化的方法激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。方法　用胞內(nei) 遊離Ca²⁺和pH熒光探針

　　fluo-3/AM和SNARF-1/AM標記小鼠腹腔巨噬細胞後，在激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570）下，同時用zui適發射波長分別為(wei) 530 nm和大於(yu) 605 nm的檢測器1和檢測器2檢測巨噬細胞內(nei) fluo-3/AM和SNARF-1/AM的熒光強度變化。結果　檢測器1和檢測器2分別隻檢測反映細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和

　　pH變化的fluo-3/AM和SNARF-1/AM所發熒光的變化；SNARF-1/AM和fluo-3/AM所發熒光相互不影響。結論　激光掃描共聚焦顯微鏡可同時檢測細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和pH的變化。

　　中圖號　R329.3

　　Simultaneous Detection of Free Cytosolic Calcium and Intracellular pH by Laser Scanning ConfocalHuang Xingxu, BaoYongyao, Huang Hui, et al.Central laboratory, First Military Medical 510515

　　microscope

　　university,

　　Abstract　Objective　Free cytosolic calcium and intracellular pH can have some changes due to certain

　　factors.It is to explore a method for simultaneous detection on the changes,that is,observation with laser scanning

　　confocal microscope.Methods　Ca²⁺-and pH-sensitive fluorescence probes of fluo-3/AM and SNARF-1/AM

　　were used to mark the peritoneal macrophages simultaneously. Then, the variations of the fluorescence were

　　detected with detector 1 （optimum emission wavelength: 530nm） and detector 2（optimum emission wavelength:＞605nm） of the laser scanning confocal microscope （ACAS570）.Results　Detector1 and 2 each detected the

　　variations of the fluorescence of fluo-3/Am or SNARF-1/AM of the Ca²⁺ or pH. The fluorescence of fluo-3/AM

　　and SNARF-1/AM did not influence each other. And the forms of the alteration in free cytosolic calcium and

　　intracellular pH of the macrophages varied when they were stimulated by different stimulators.Conclusion　Laser

　　scanning confocal microscope could be used in simultaneous detection of free cytosolic calcium and intracellular

　　pH.

　　Key words　microscopy,fluorescence/methods;macrophages/physiol;calcium/anal;acid-base equilibrium;

　　mice

　　細胞受各種因素作用時，胞內(nei) Ca²⁺和pH發生變化^〔1〕，不過由於(yu) 缺乏能同時檢測胞內(nei) Ca²⁺和

　　pH動態變化的方法，二者之間的關(guan) 係仍不很清楚。近年來，隨著激光掃描共聚焦顯微鏡技術和熒光探針的開發利用^〔2〕，新一代的胞內(nei) 遊離Ca²⁺和pH熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM被分別用於(yu) 胞內(nei) 遊離Ca²⁺和pH變化的檢測^〔3,4〕。根據fluo-3/AM和胞內(nei) 遊離Ca²⁺結合後在波長530 nm處熒光強度隨遊離Ca²⁺濃度升高而增強，而SNARF-1/AM的熒光強度在波長＞605 nm時隨胞內(nei) pH升高而增強，它們(men) 的激發波長均為(wei) 480 nm^〔5,6〕以及fluo-3/AM的熒光強度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕等特點，我們(men) 設計了本實驗，擬利用fluo-3/AM和SNARF-1/AM混合物同時著染巨噬細胞，以觀察巨噬細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和pH的動態變化。

材 料 和 方 法

　　一、主要材料

　　帶雙檢測器的激光掃描共聚焦顯微鏡（ACAS570），美國Meridian公司生產(chan) 。fluo-3/AM、

　　sNARF-1/AM，美國Molecular probes Inc產(chan) 品。RPMI－1640、Hepes購於(yu) Sigma公司。小牛血清，浙江杭州四青生物材料廠製品。其它試劑均為(wei) 分析純。

　　二、細胞培養(yang)

　　體(ti) 重20 g左右雌正常昆明小鼠，按照鄂征等人的方法^〔7〕取腹腔巨噬細胞，以5×10⁵個(ge) /cm²的濃度接種於(yu) 改裝35 mm Petri細胞培養(yang) 皿底部的蓋玻片上，用含10％小牛血清的RPMI－1640培養(yang) 於(yu) 37^oC含5％CO₂的孵育箱內(nei) 。

　　三、熒光探針標記

　　吸除培養(yang) 皿內(nei) 的培養(yang) 液，用Hepes緩衝(chong) 鹽溶液洗三次，分別在不同培養(yang) 皿中滴入10μmol/L

　　fluo-3/AM、10μmol/L sNARF-1/AM和含10μmol/L fluo-3/AM和10μmol/L sNARF-1/AM的混合液0.3 ml，37^oC孵育30～60分鍾，吸除染液，用Hepes緩衝(chong) 鹽溶液洗3次，再加入0.5 ml Hepes緩衝(chong) 鹽溶液。

　　四、ACAS570檢測胞內(nei) Ca²⁺和pH

　　將培養(yang) 皿置於(yu) ACAS570載物台上，選用40×物鏡，7％濾光片，確定激發光波長為(wei) 488 nm，進入Ratio－Generic－Image scan程序，打開檢測器1（zui適發射波長530 nm）和檢測器2（zui適發射波長大於(yu) 605 nm），建立文件，作預掃描後選定*掃描參數，對選定視野掃描並存儲(chu) 所獲信息。主要掃描參數如下：Pinhole1 600μm, pMT1 70%, PMT2 70%, Scanning Strength 20%, Laser

　　power 10 mW。

　　五、單檢Ca²⁺或pH時按張薇等人的方法^〔4〕，分別打開檢測器1或2進行。

　　六、分析

　　雙檢分析進入Ratio－Generic－Image analysis程序，調入分析文件，得出同時反映細胞內(nei) Ca²⁺和pH動態變化的熒光強度變化曲線。單檢分析進入Kinetics－Image－Analysis程序，分別調入分析文件，得出各自反映細胞內(nei) Ca²⁺或pH動態變化的熒光強度變化曲線。

結 果

　　一、細胞熒光圖像

　　圖1和圖2分別為(wei) 檢測器1和檢測器2同時打開時檢測到的fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細胞熒光圖像。圖1顯示僅(jin) 檢測器1檢測到fluo-3/AM所發熒光，同樣，圖2顯示僅(jin) 檢測器2檢測到SNARF-1/AM所發熒光。

　　二、單測巨噬細胞內(nei) Ca²⁺和pH的變化

　　單檢結果顯示，小鼠巨噬細胞未受到刺激時，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度不變，巨噬細胞內(nei) 的Ca²⁺和pH穩定；加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）後200 sec，fluo-3/AM的熒光強度下降了0.45，SNARF-1/AM的熒光強度下降了0.2；加入腎上腺素（終濃度1μmol/L）後200 sec，

　　fluo-3/AM的熒光強度上升0.35，SNARF-1/AM熒光強度下降0.2。

　　三、雙測巨噬細胞內(nei) Ca²⁺和pH的變化

　　雙檢結果顯示，顯示小鼠巨噬細胞未受到刺激時，fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度同樣不變。加入維拉帕米（終濃度1μmol/L）後200 sec，fluo-3/AM的熒光強度下降了0.42，SNARF-1/AM的熒光強度下降了0.22（圖3）；加入腎上腺素（終濃度1×10μmol/L）後200 s，fluo-3/AM的熒光強度上升0.36，SNARF-1/AM熒光強度下降0.21（圖4）。

　　圖3 歸一化維拉帕米（1μmol/L）處理巨噬細胞內(nei) fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度變化曲線圖,檢測器1表示fluo-3/AM的熒光強度變化,檢測器2表示SNARF-1/AM的熒光強度變化,標記示加樣時間圖4 歸一化腎上腺素（1μmol/L）處理巨噬細胞內(nei) fluo-3/AM和SNARF-1/AM熒光強度變化曲線圖,檢測器1表示fluo-3/AM的熒光強度變化,檢測器2表示SNARF-1/AM的熒光強度變化,標記示加樣時間

　　圖1　細胞內(nei) 遊離鈣特異熒光屏　flou-3/AM熒光圖，檢測器1可檢測到fluo-3/AM的熒光，但

　　幾乎未檢測到任何SHARF-1/AM的熒光圖2　細胞胞漿_PH特異熒光探針SNARF-1/AM的熒光圖，檢測器2可檢測到SNARF-1/AM的熒光，

　　但幾乎未檢測到任何flou-3/AM的熒光

討 論

　　檢測器1和檢測器2隻檢測到fluo-3/AM和SNARF-1/AM的細胞熒光圖像，表明檢測器1和檢測器2均有較嚴(yan) 格的zui適發射波長，適合同時檢測波長不同，特別是波長相差較大的熒光。而且，經維拉帕米和腎上腺素作用後，單檢和雙檢結果顯示fluo-3/AM的熒光強度變化和SNARF-1/AM的熒光強度變化均基本一致。這不僅(jin) 證實了fluo-3/AM的熒光強度不受SNARF-1/AM影響^〔3〕，也反映出SNARF-1/AM的熒光強度不受fluo-3/AM影響。這些，肯定了在激光掃描共聚焦顯微鏡下可用熒光探針fluo-3/AM和SNARF-1/AM同時檢測活細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和胞漿pH的動態變化，從(cong) 而為(wei) 探討細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和胞漿pH之間的關(guan) 係創造了條件。

　　實驗結果表明,新近開發的激光掃描共聚焦顯微鏡技術不僅(jin) 可作原位實時動態檢測,具有實驗過程快速, 樣品處理簡便, 得到數據全麵等優(you) 點^〔2〕。還能顯示單個(ge) 細胞的熒光強度變化，將檢測提高到單細胞水平。而且由於(yu) 共焦鏡法實現了對活細胞熒光強度變化的連續追蹤，因而可準確反映細胞在加樣瞬間的變化。

　　細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和胞漿pH均與(yu) 細胞功能相關(guan) ^〔8〕。心肌細胞內(nei) 遊離Ca²⁺升高伴隨胞漿酸化^〔9〕。

　　對巨噬細胞遊離Ca²⁺及胞漿pH關(guan) 係的初步研究結果顯示，盡管經腎上腺素處理,巨噬細胞遊離Ca²⁺及胞漿pH的變化和心肌細胞相似。但經維拉帕米作用後，巨噬細胞胞漿pH和遊離Ca²⁺均降低。這表明巨噬細胞胞漿pH變化並不象心肌細胞一樣由細胞內(nei) 遊離Ca²⁺升高引起。巨噬細胞內(nei) 遊離Ca²⁺和胞漿pH之間的確切關(guan) 係仍需進一步探討。

　　參 考 文 獻

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　　2 Davin MS. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. J Cell Science,

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　　3 Rijkers GT, Justement LB, Griffioen AW, et al. Improved method for measuring intracellular Ca²⁺ with fluo-3.

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　　4 張薇，樸英傑，鮑永耀，等.粘附式細胞儀(yi) 測定巨噬細胞內(nei) 遊離鈣的方法.*軍(jun) 大學學報，

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　　microspectrofluorometry: A critical assessment. Anal Biochem, 1991, 193: 49-54.

　　6 Richard PH, Molecular Probe. Handbook of fluorescent probes and research chemicals, 5th Edition, USA,

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