ELISA原理，以及操作步聚

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之後發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用於(yu) 生物學和醫學科學的許多領域。   　　（一）　原理 ELISA是以免疫學反應為(wei) 基礎，將抗原、抗體(ti) 的特異性反應與(yu) 酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於(yu) 抗原、抗體(ti) 的反應在一種固相載體(ti) ──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘(yu) 的遊離反應物，從(cong) 而保證試驗結果的特異性與(yu) 穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體(ti) 的方法步驟可有多種。即:用於(yu) 檢測抗體(ti) 的間接法（圖a）、用於(yu) 檢測抗原的雙抗體(ti) 夾心法（圖b）以及用於(yu) 檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭(zheng) 法等等。比較常用的是ELISA雙抗體(ti) 夾心法及ELISA間接法。   　　（二）　操作步驟 　　方法一　用於(yu) 檢測未知抗原的雙抗體(ti) 夾心法: 　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝(chong) 液將抗體(ti) 稀釋至蛋白質含量為(wei) 1～10μg／ml。在每個(ge) 聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nei) 溶液，用洗滌緩衝(chong) 液洗3次，每次3分鍾。（簡稱洗滌，下同）。 　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。 　　3.　加酶標抗體(ti) ：於(yu) 各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(ti) （經滴定後的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。 　　4.　加底物液顯色：於(yu) 各反應孔中加入臨(lin) 時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鍾。 　　5.　終止反應：於(yu) 各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。 　　6.　結果判定：可於(yu) 白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內(nei) 顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為(wei) 無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀(yi) 上，於(yu) 450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零後測各孔OD值，若大於(yu) 規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為(wei) 陽性。 　　方法二　用於(yu) 檢測未知抗體(ti) 的間接法： 　　　　　　用包被緩衝(chong) 液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 　　　　　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體(ti) ）0.1ml於(yu) 上述已包被之反應孔 　　　　　　中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） 　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　於(yu) 反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(ti) （抗抗體(ti) ）0.1ml， 　　　　　　37℃孵育30-60分鍾，洗滌,zui後一遍用DDW洗滌。 　　　　　　　　　　　　　　↓ 其餘(yu) 步驟同“雙抗體(ti) 夾心法”的4、5、6。   　　（三）　試劑器材 　　1.　試劑 　　（1）　包被緩衝(chong) 液（PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝(chong) 液）: 　　　　　　NaHCO３   1.59克 　　　　　　NaHCO３　 2.93克 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　（2）　洗滌緩衝(chong) 液（PH7.4 PBS）：0.15M 　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克 　　　　　　Na2HPO４·12H2O　　2.9克 　　　　　　NaCl　　　　　　　8.0克 　　　　　　KCl　　　　　　　　0.2克 　　　　　　Tween-20　0.05％　0.5ml 　　　　　　加蒸餾水至1000ml 　　（3）　稀釋液： 　　　　　　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克 　　　　　　　加洗滌緩衝(chong) 液至100ml 　　　　或以羊血清、兔血清等血清與(yu) 洗滌液配成5～10％使用。 　　（4）　終止液（2M　H２SO４）： 　　　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。 　　（5）　底物緩衝(chong) 液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）: 　　　　0.2M Na２HPO４（28.4克／L） 25.7ml 　　　　0.1M 檸檬酸（19.2克／L）　　　　　 24.3ml 　　　　加蒸餾水50ml。 　　（6）　TMB（四甲基聯苯胺）使用液: 　　　　TMB（10mg／5ml無水乙醇） 0.5ml 　　　　底物緩衝(chong) 液（PH5.5）　　　 10ml 　　　　0.75％H２O２　　 　32μl 　　（7）　ABTS使用液: 　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg 　　　　底物緩衝(chong) 液（PH5.5）　 1ml 　　　　3％H２O２　 　2μl 　　（8）　抗原、抗體(ti) 和酶標記抗體(ti) 。 　　（9）　正常人血清和陽性對照血清。 　　2.　器材: 　　（1）　聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀(yi) ，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。 　　（2）　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。 （3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。   　　（四）　注意事項 　　1.　正式試驗時，應分別以陽性對照與(yu) 陰性對照控製試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。 　　2.　在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括: 　　（1）　固相載體(ti) 的選擇：許多物質可作為(wei) 固相載體(ti) ，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體(ti) ，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。 　　（2） 包被抗體(ti) （或抗原）的選擇：將抗體(ti) （或抗原）吸附在固相載體(ti) 表麵時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對於(yu) 多數蛋白質來說通常為(wei) 1～10μg／ml。 　　（3）　酶標記抗體(ti) 工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價(jia) 的滴定（見酶標記抗體(ti) 部份）。然後再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體(ti) 分別為(wei) 不同的稀釋度）在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。 　　（4）　酶的底物及供氫體(ti) 的選擇：對供氫體(ti) 的選擇要求是價(jia) 廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(ti) （如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體(ti) ，如TMB和ABTS是目前較為(wei) 滿意的供氫體(ti) 。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為(wei) 宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨(lin) 用前加入。