Western Blot 原理和操作方法

Western Blot 工作原理 蛋白質的電泳分離是重要的生物化學分離純化技術之一,電泳是指帶電粒子在電場作用下,向著與(yu) 其電荷相反的電極移動的現象.根據所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,澱粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）由於(yu) 無電滲作用,樣品用量少（1-100μg）,分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機械強度大,重複性好以及可以通過調節單體(ti) 濃度或單體(ti) 與(yu) 交聯劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(you) 點而受到廣泛的應用. SDS-PAGE是zui常用的定性分析蛋白質的電泳方式,特別是用於(yu) 蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量. PAGE能有效的分離蛋白質,主要依據其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE（SDS變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳）的分離原理則僅(jin) 根據蛋白質的分子量的差異,因為(wei) SDS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇（2-ME）或二巰基赤蘚醇（DTT）,其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質的四級結構,SDS是一種陰離子表麵活性劑即去汙劑,它可以斷開分子內(nei) 和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級及三級結構,並與(yu) 蛋白質的疏水部分相結合,破壞其折疊結構,電泳樣品假如樣品緩衝(chong) 液後,要在沸水中煮3-5分鍾使SDS與(yu) 蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質複合物,SDS-蛋白質複合物在強還原劑巰基乙醇存在時,蛋白質分子內(nei) 的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質也*變性和解聚,並形成榛狀結構,穩定的存在於(yu) 均一的溶液中,SDS與(yu) 蛋白質結合後使SDS-蛋白質複合物上帶有大量的負電荷,平均每兩(liang) 個(ge) 氨基酸殘基結合一個(ge) SDS分子,這時各種蛋白質分子本身的電荷*被SDS掩蓋,遠遠超過其原來所帶的電荷,從(cong) 而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決(jue) 於(yu) 亞(ya) 基分子質量的大小,這樣分離出的譜帶也為(wei) 蛋白質的亞(ya) 基. 樣品處理液中通常加入溴酚藍染料, 溴酚藍指示劑是一個(ge) 較小的分子,可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當指示劑到達凝膠底部時,即可停止電泳. 另外樣品處理液中也可加入適量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部. 重要參數 ①聚丙烯酰胺凝膠（PAG）製備原則:由於(yu) 孔徑的大小取決(jue) 於(yu) 單體(ti) 和雙體(ti) 丙烯酰胺在凝膠中的總濃度（T）以及雙體(ti) 占總濃度的百分含量即交聯度（C）決(jue) 定的,因而製膠之前必須首先知道這兩(liang) 個(ge) 參數.一般可以由下述公式計算: T%=（a+b）/m*100%; 和 C%=a/（a+b）*100% 其中: a=雙體(ti) （bis）的重量 ;b=單體(ti) （arc）的重量 ;m=溶液的體(ti) 積（ml） ②當分析一個(ge) 未知樣品時,常常先用7.5%的標準凝膠製成4-10的梯度凝膠進行試驗,以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度: 蛋白質分子量範圍（Da） 適宜的凝膠濃度（%） <104 20-30 1×104-4×104 15-20 4×104-1×105 10-15 1×105-5×105 5-10 >5×105 2-5 ③分離膠: 電泳凝膠濃度 試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15% H2O（ml） 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.4 30%丙烯酰胺（T: 30%,C: 3%（ml） 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.5 1.5mol/lTris.cl（PH8.8） （ml） 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 10%SDS（ml） 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 10%AP（ml） 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 TEMED（μl） 4 4 4 6 6 6 總體(ti) 積（ml） 10 15 ④濃縮膠 試劑 濃度（5%） H2O（ml） 4 2 30%丙烯酰胺（T: 30%,C: 3%（ml） 1 0.5 1.0mol/lTris.cl（PH8.8） （ml） 1 0.5 10%SDS（μl） 80 40 10%AP（μl） 60 30 TEMED（μl） 8 4 總體(ti) 積（ml） 6 3 蛋白質的樣品製備： 蛋白質的樣品製備是Western Blotting的*步，樣品製備是關(guan) 鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題： 1：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的zui大溶解性和可重複性。 2：選擇合適的表麵活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jia) 結合的蛋白質複合物和共價(jia) 鍵二硫鍵，使其形成一個(ge) 各自多肽的溶液。 3：盡量去除核酸，多糖，脂類等幹擾分子。 4：防止蛋白質在樣品處理過程中的人為(wei) 的修飾，製備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑製劑） 5：樣品建議分裝成合適的量，然後冷凍幹燥或直接以液體(ti) 狀態置-80℃中保存，但要注意不要反複凍融。 一：準備工作： 一個(ge) 水浴箱，一台超聲裝置，組織勻漿器 二：需要的溶液： 裂解液 Laemmli樣品緩衝(chong) 液 三：操作步驟： 1）培養(yang) 細胞蛋白質樣品的製備： 1：胰酶酶解後裂解： 　細胞培養(yang) 至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細胞經預冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反複吹打。 2：皿上直接裂解： 細胞培養(yang) 至80%左右密度時，細胞經預冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉移至離心管中，反複吹打。 以上所得的樣品zui終用超聲細胞破碎儀(yi) 超聲處理，超聲時為(wei) 5S，間歇時間為(wei) 10S，功率為(wei) 100-120W至溶液清澈無粘稠為(wei) 止，處理過程在水浴中進行，後4℃25000g離心1小時取上清或以zui大強度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩衝(chong) 液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強力混勻，樣品置100℃水浴箱裏水浴加熱3-5分鍾，10000g離心10分鍾，取出清液，將其移入另一潔淨試管中，至此，電泳樣品已準備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月） 2）組織樣品的製備： 手術切除的組織塊迅速置於(yu) 預冷的0.95生理鹽水中，漂洗數次，以清潔表麵的血跡，將組織稱量後切成幾個(ge) 較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織淨重，裂解液=1：10的比例，加入相應體(ti) 積的裂解液進行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體(ti) 方法見細胞培養(yang) 的樣品製備，也可以冷凍幹燥降解核酸後，將凍幹的蛋白質樣品溶解在適當的上樣 buffer中，混勻後靜置3小時使樣品中的蛋白質充分的溶解，有5分鍾即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩衝(chong) 液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鍾，10000g離心10分鍾，取上清液，將其轉入另一潔淨的試管中，至此，電泳樣品已準備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月。） 蛋白質的樣品製備： 蛋白質的樣品製備是Western Blotting的*步，樣品製備是關(guan) 鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質，應注意以下問題： 1：在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的zui大溶解性和可重複性。 2：選擇合適的表麵活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jia) 結合的蛋白質複合物和共價(jia) 鍵二硫鍵，使其形成一個(ge) 各自多肽的溶液。 3：盡量去除核酸，多糖，脂類等幹擾分子。 4：防止蛋白質在樣品處理過程中的人為(wei) 的修飾，製備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑製劑） 5：樣品建議分裝成合適的量，然後冷凍幹燥或直接以液體(ti) 狀態置-80℃中保存，但要注意不要反複凍融。 一：準備工作： 一個(ge) 水浴箱，一台超聲裝置，組織勻漿器 二：需要的溶液： 裂解液 Laemmli樣品緩衝(chong) 液 三：操作步驟： 1）培養(yang) 細胞蛋白質樣品的製備： 1：胰酶酶解後裂解： 　細胞培養(yang) 至80%左右密度時，以含0.05%胰蛋白酶消化，細胞經預冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反複吹打。 2：皿上直接裂解： 細胞培養(yang) 至80%左右密度時，細胞經預冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細胞刮刀收集，用移液器轉移至離心管中，反複吹打。 以上所得的樣品zui終用超聲細胞破碎儀(yi) 超聲處理，超聲時為(wei) 5S，間歇時間為(wei) 10S，功率為(wei) 100-120W至溶液清澈無粘稠為(wei) 止，處理過程在水浴中進行，後4℃25000g離心1小時取上清或以zui大強度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩衝(chong) 液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強力混勻，樣品置100℃水浴箱裏水浴加熱3-5分鍾，10000g離心10分鍾，取出清液，將其移入另一潔淨試管中，至此，電泳樣品已準備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月） 2）組織樣品的製備： 手術切除的組織塊迅速置於(yu) 預冷的0.95生理鹽水中，漂洗數次，以清潔表麵的血跡，將組織稱量後切成幾個(ge) 較小的組織塊放入機戒組織勻漿器中，按組織淨重，裂解液=1：10的比例，加入相應體(ti) 積的裂解液進行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體(ti) 方法見細胞培養(yang) 的樣品製備，也可以冷凍幹燥降解核酸後，將凍幹的蛋白質樣品溶解在適當的上樣 buffer中，混勻後靜置3小時使樣品中的蛋白質充分的溶解，有5分鍾即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩衝(chong) 液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鍾，10000g離心10分鍾，取上清液，將其轉入另一潔淨的試管中，至此，電泳樣品已準備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩定保持數月。） 附： 一：裂解液的製備： 組織裂解液（全細胞蛋提取）：1：Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.4 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧膽酸鈉 0.25% 4：NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6： PMSF 1 mmoL/L 7： Aprotinin 1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 細胞裂解液：1：NP-40裂解體(ti) 係：　150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 50 mmoL/L Tris（PH8.0） 2：RIPA裂解體(ti) 係：150 mmoL/L Nacl 1.0%NP-40或Triton-x-100 0.5%脫氧膽酸鈉 0.1%SDS 50 mmoL/L Tris（ ph8.0） 二：Laemmli 樣品緩衝(chong) 液配置（1*SDS樣品緩衝(chong) 液） 50 mmoL/L Tris-HCL （PH8.0） 100 mmoL/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚藍 10% 甘油 此液可以配置成不同的儲(chu) 存液，根據蛋白濃度而定，40C長期保存，用時臨(lin) 時與(yu) 蛋白液按比例混合，其中DTT應臨(lin) 時加入，以防降解。 蛋白質定量 1）Bradford法: 檢測原理: Bradford與(yu) 蛋白質四級結構,特殊氨基酸結合,由棕色變成藍色,595nm檢測.該方法用於(yu) 大多數蛋白質的定量是比較的,但不使用於(yu) 小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去汙劑的濃度超過0.2%影響測定結果,如TritonX-100,SDS,NP-40等. ①Bradford法濃染液的配製:將100mg考馬斯亮藍G-250溶於(yu) 50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然後,用蒸餾水補充至200ml;此染液放4℃至少6個(ge) 月保持穩定. ②標準曲線蛋白質樣本的製備:盡量使用與(yu) 待測樣本性質相近的蛋白質作為(wei) 標準品,例如測定抗體(ti) ,可用純化的抗體(ti) 作為(wei) 標準,如果待測樣品是未知的,也可用抗體(ti) 作為(wei) 標準蛋白,通常在20μg -150μg/100μl之間繪製標準曲線. ③將待測樣本溶於(yu) 100μl緩衝(chong) 溶液中,該緩衝(chong) 溶液相同（用PBS） ④按照1:5用水稀釋濃燃料結合溶液,如果出現沉澱,過濾除去. ⑤每個(ge) 樣品家5ml稀釋的燃料結合溶液,作用5-30分鍾,燃料與(yu) 蛋白結合,將由紅色變為(wei) 蘭(lan) 色,在595nm波長下測定其吸光度,注意顯色反應不超過30分鍾. ⑥根據標準曲線計算待測樣品的濃度.　 2）Lowry法: 檢測原理: 是Cu2+與(yu) 蛋白作用生成的Cu+與(yu) 雙縮脲試劑形成蘭(lan) 色絡合物,菲林試劑增強蘭(lan) 色形成,750nm檢測. ①首先,將20g碳酸鈉溶於(yu) 500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶於(yu) 500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲(chu) 存於(yu) 冰箱中,可穩定保存1年以上. ②Folin-ciocalteu酚試劑 ③按體(ti) 積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲(chu) 藏,可穩定保存2周,標明為(wei) 試劑A ④按體(ti) 積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲(chu) 存於(yu) 琥珀色試劑瓶中,可穩定保存1個(ge) 月,表明為(wei) 時機B ⑤用蒸餾水將樣本（5-100μg）稀釋為(wei) 1ml,並準備100,50,25,12.5μg /ml,4個(ge) 濃度的BSA作為(wei) 標準蛋白. ⑥每個(ge) 蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鍾. ⑦加入0.5 ml試劑B並立即混合, 在室溫下孵育30分鍾. ⑧在750nm光波長下測定吸光度;根據標準曲線計算樣本蛋白質的濃度. 3）紫外分光光度法: 檢測原理:是因蛋白質樣品在280nm波長下有zui大吸光率,zui大吸光率主要取決(jue) 於(yu) 酪氨酸和色氨酸的存在. ①純化蛋白質濃度的測定:在280nm波長下讀取與(yu) 適當對照相比較的吸光值. ②對於(yu) 抗體(ti) 和BSA,可按照下述標準計算其濃度,對其他蛋白質粗略地估計:1單位吸光值相當於(yu) 1mg/ml 蛋白質 A280（1mg/ml） IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7 ③含有核苷酸的蛋白質溶液濃度的測定: 蛋白質濃度（mg/ml）=（1.55*A280）-（0.76*A260） 蛋白質濃度（mg/ml）=A205（27+120A280/A205） 1）SDS-PAGE設備和材料 ①電泳裝置（垂直板電泳槽）為(wei) 北京六一儀(yi) 器廠生產(chan) 的DYCZ-24D型電泳裝置。 ②電泳儀(yi) （電源）為(wei) 北京六一儀(yi) 器廠生產(chan) 的DYY-8B型。 ③振蕩器 2）試劑 ①丙烯酰胺（電泳級） ②N,N′-甲叉雙丙烯酰胺（bis） ③SDS ④TEMED ⑤Tris ⑥過硫酸銨 ⑦α-巰基乙醇或DTT ⑧甘油 ⑨甘氨酸 ⑩溴酚藍 （11）鹽酸 3）聚膠前準備： ①配製凝膠儲(chu) 液： T%=30% C%=1% arc:bis=29:1　過濾後4℃避光保存。 ②配製濃縮膠緩衝(chong) 液： 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 　過濾後4℃避光保存。 ③配製分離膠緩衝(chong) 液： 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 　過濾後4℃避光保存。 ④配製10%SDS ⑤配製10%過硫酸銨（AP） ⑥TEMED原溶液 ⑦電泳緩衝(chong) 液（5×）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨(lin) 用時稀釋5倍至1×SDS電泳緩衝(chong) 液加入電泳槽中。 4）製膠: 　製膠關(guan) 鍵是聚合時間,是分離膠聚合控製在分離膠從(cong) 加入10%AP和TEMED起至開始出現凝膠的時間為(wei) 15-20分鍾（並不是此時已凝聚*）。對濃縮膠*聚合速度為(wei) 8-10min開始可見聚合，可以通過調節AP和TEMED的加入量來控製，因液體(ti) 中含有分子氧可抑製凝膠的聚合，故用時可在真空中抽氣以排除液體(ti) 中的分子氧，灌完分離膠後加水以封閉分離膠與(yu) 外界氧氣的結合，總之，要掌握一個(ge) 原則：即用盡量少的催化劑在*時間聚合。 ①按比例配製分離膠，輕緩地搖動溶液（8-10下），使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩(liang) 層玻璃極中，再在液麵上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進入凝膠溶液中，然後靜置90min。 ②同前按比例配製濃縮膠，但搖動溶液時不要過於(yu) 劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續係統中下層分離膠上的水分，以連續平穩的液流注入凝膠溶液，然後小心插入梳子並注意不得在齒尖留有氣泡，靜製90min以上以保證*聚合。 5）預電泳： 將聚合好的凝膠安置於(yu) 電泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽電泳緩衝(chong) 液後低電壓短時間的預電泳（恒壓10-20V,20-30min），清除凝膠內(nei) 的雜質，疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通。 6）加樣： 預電泳後依次加入標準品和待分析樣品，注意加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，為(wei) 避免邊緣效應，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩衝(chong) 液。 7）電泳： 加樣完畢，蓋好電泳槽的蓋子並選擇適當的電壓進行電泳，通常在連續係統中，上層濃縮膠的電泳電壓要低於(yu) 分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進入凝膠，電泳時，應采用恒壓的模式，這樣蛋白質才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V，分離膠120V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。 8）染色和脫色 電泳完畢需通過染色和脫色評定其結果的優(you) 劣.對凝膠中分離成不同條帶的蛋白進行檢測.此外,根據不同的研究目的,也可將凝膠電印跡 ①考馬斯亮藍染色: 將凝膠取出放入培養(yang) 皿中到如少量的染色液,以浸沒凝膠為(wei) 宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現明顯的條帶為(wei) 止,一般5-6小時或者4℃過夜;然後傾(qing) 去染色液，用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色稍清亮.,凝膠背景清楚為(wei) 止. ②染色液配製: 90ml甲醇和H20混合溶液（甲醇:水=1:1,V/V）和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍R250用濾紙過濾染液以除去顆粒不溶性物質. ③脫色液的配製: 90mL（甲醇）:H20（1:1 V/V）和10ml冰乙酸溶液. 附： 一、蛋白標準品的選擇 凝膠電泳中一個(ge) 關(guan) 鍵的指示係統，即蛋白標準品（Molecular Weight Marker），電泳的分離效率，轉膜效率以及電泳泳動情況等，皆需通過蛋白標準品來顯示，目前普遍采用的幾種蛋白標準品有： ① Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix ② Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix 以上兩(liang) 種Marker均為(wei) PIERCE公司的產(chan) 品，貨號為(wei) ：①prod# 26681; ②prod# 26691;該標準蛋白不需染色，在電泳凝膠中隨著蛋白質的遷移，各種分子質量的標準蛋白逐漸分開，而顯示出非常漂亮的多色條帶，可通過電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動情況，當相對於(yu) 目的蛋白大小的標準蛋白與(yu) 相鄰兩(liang) 條標準蛋白達到所需分辨距離時，即可停止電泳，取出凝膠做進一步的轉膜工作。 ③ Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labled protein Molecular Weight Marker Mix 以上也為(wei) PIERCE產(chan) 品，貨號為(wei) ：prod# 26651，該標準蛋白同上也具有以上作用外，同時在使用化學發光時，和樣品一起顯色經膠片曝光後，在膠片上可出現漂亮的條帶。 ④ Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix 以上為(wei) Sigma公司產(chan) 品，貨號為(wei) B2787,作用效果同③ 二、對照的設置 一般需要設立: 內(nei) 參照, 提示係統的穩定性,一般是一些管家蛋白 陽性對照, 即肯定可以表達你的目的蛋白的組織或者細胞,同時可以提示你一抗的質量 陰性對照: 即肯定不會(hui) 表達你的目的蛋白的組織或者細胞.在實驗中 根據你的需要選擇 免疫印跡 蛋白質印跡法是將蛋白質混合樣品經SDS-PAGE後,分離為(wei) 不同條帶,其中含有能與(yu) 特異性抗體(ti) （或McAb）相應的待檢測的蛋白質（抗原蛋白）,將PAGE膠上的蛋白條帶轉移到NC膜上此過程稱為(wei) blotting,以利於(yu) 隨後的檢測能夠的進行,隨後,將NC膜與(yu) 抗血清一起孵育,使*抗體(ti) 與(yu) 待檢的抗原決(jue) 定簇結合（特異大蛋白條帶）,再與(yu) 酶標的第二抗體(ti) 反應,即檢測樣品的待測抗原並可對其定量. 一、 設備和材料 轉移電泳槽和轉移電泳儀(yi) （電源） 震蕩器 冰箱 濾紙 NC膜 膠片 暗室 二、 試劑 封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T *抗體(ti) （Ab1） 第二抗體(ti) （標記的Ab2） 底物以及顯色指示劑 漂洗液（TBS-T） 轉印緩衝(chong) 液 抗體(ti) 稀釋液 麗(li) 春紅S 顯影液 定影液 三、 試劑的配製 封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T 漂洗液（TBS-T）: 0.01M TBS-T為(wei) Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調節PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml 轉印緩衝(chong) 液: 同5×SDS電泳緩衝(chong) 液,不含SDS,如果采用PVD幹膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以 Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調節PH值 ,用時稀釋5倍到1×轉印緩衝(chong) 液. 顯影液：H2O--750ml 米土爾--3g 無水亞(ya) 硫酸鈉---100g 對苯二酚---3g 溴化鉀---3g 無水碳酸鈉：先加5gPH10.0不夠時再加5g 注：以上配定加H2o定容至1000ml 定影液：起始水溫：60℃ H2o 700ml 硫代硫酸鈉：240g 無水亞(ya) 硫酸鈉：25g 冰醋酸：48ml 注：加H2o至1000ml 四、　電印跡 蛋白質經SDS-PAGE分離後，必須從(cong) 凝膠中轉移到固相支持物上，固相支持物具有牢固結合蛋白又不影響蛋白質Ag活性，而且支持物本身還有免疫反應惰性等特點，常用的支持物有：硝酸纖維膜（NC膜）或PVDF膜。 蛋白質從(cong) 凝膠向膜轉移的過程普遍采用電轉印法，分為(wei) 半幹式和濕式轉印兩(liang) 種模式。 一． 半幹式電轉印 1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結束後，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩衝(chong) 液中漂洗數秒。取凝膠方法：用刀片將兩(liang) 玻璃板分開，將多餘(yu) 的凝膠劃去，上部以濃縮膠為(wei) 準全部棄去，下部以分子量標準zui小分子帶下一點全部劃去，取一10ml注射器注滿轉印緩衝(chong) 液，插入玻璃板與(yu) 凝膠之間注水，使水的壓力將兩(liang) 者自然分開,邊推邊進,反複多次注水,直至凝膠從(cong) 玻璃板上滑落下來。 2. 將NC膜和濾紙切出與(yu) 凝膠一樣大小，置轉移緩衝(chong) 液中濕潤5-10min. 3. 按照以下順序放置濾紙，凝膠和NC膜到半幹槽中。 4. 每層之間的氣泡要全部去除。可以用10ml吸管輕輕在上一層滾動去除氣泡，然後用*緣的塑料片中間挖空與(yu) 凝膠一樣大小或略小一點，以防電流直接從(cong) 沒有凝膠處通過造成短路，蓋好加上陽極電極板。 二．濕式電轉印 1.    Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結束後，取出凝膠，在Tris/甘氨酸緩衝(chong) 液中漂洗數秒。取出凝膠方法同半幹式電轉印。 2.    打開電轉印夾，每側(ce) 墊上一塊的用轉印液浸泡透的海麵墊，再各放一塊轉印液浸透的濾紙，濾紙與(yu) 海麵墊大小相同或與(yu) NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(ce) 濾紙上，zui後將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉印夾。 3.    電泳槽加滿電轉印液，插入電轉印夾，將電泳槽放入冰箱內(nei) （電轉印液之前要放入冰箱內(nei) 預冷），連接好電極，接通電流，轉印夾的NC膜應對電泳槽的正極。 五、印跡膜上總蛋白的染色 在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過對硝酸纖維素膜染色可以了解轉印至膜上的總蛋白質的組成情況,並可確定蛋白質分子質量標記物的位置和確定轉印成功,同時,該方法也清楚地顯示出轉印蛋白質的複雜性. 麗(li) 春紅S印跡膜染色法： 麗(li) 春紅S適用於(yu) 酸性水溶液,染色但是不持久,在後續的處理中紅色染料易被洗去,由於(yu) 與(yu) 蛋白質的結合是可逆性的,該染色方法適用於(yu) 所有顯示抗原的餓技術, 麗(li) 春紅S帶負電荷,可以與(yu) 帶正電賀的氨基酸殘基結合,同時麗(li) 春紅也可以與(yu) 蛋白的非極性區相結合,從(cong) 而形成紅色條帶. 1）麗(li) 春紅溶液的配製: 儲(chu) 存液（10×）： 0.1g麗(li) 春紅溶於(yu) 5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨(lin) 用前稀釋10倍為(wei) 應用液. 2）操作步驟 ①轉印結束後取出印跡膜至於(yu) 麗(li) 春紅S應用液中,並在室溫下攪動5-10分鍾 ②將膜放入PBS洗數次,每次1-2分鍾,並且更換PBS ③根據需要將轉印部位和分子量標準位置進行標記 至此膜可以用於(yu) 封閉和加入抗體(ti) 六、膜的封閉 在進行抗體(ti) 雜交之前，需要先對轉印膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一般采用異源性蛋白質或去汙劑，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及5% No-fat milk等，至於(yu) 選擇哪一類封閉液，首先應考慮與(yu) 檢測試劑相適應，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用檢測試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以20%BSA效果較好，其次是5%N-fat milk. 封閉過程： 1） 洗轉印膜：室溫漂洗3次x10min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響後麵的抗體(ti) 結合。 2） 取漂洗的轉印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內(nei) ，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4度過夜。 3） 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min. 七、抗體(ti) 雜交 抗體(ti) 表麵主要采用間接法。即先加入未標記特異性抗體(ti) （Ab1）與(yu) 膜上抗原結合，再加入標記的抗抗體(ti) （Ab2）進行雜交檢測，標記Ab2 物質有放射性核素，酶，以及生物素等。 雜交過程： １）封閉後的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體(ti) 稀釋液稀釋的Ab1濃度為(wei) 1ug/ml，封口，4℃孵育過夜或室溫（22-25℃）搖動孵育2h. ２） 液洗膜3次x10min ３）標記的Ab2（羊抗兔-HRP）室溫1h，洗膜3x10min 八、檢測 根據標記Ab2的標記物不同,其雜交的結果檢測方法也不同,較常用的檢測係統有HRP標記 Ab2的的增強化學發光（ECL）和DAB檢測係統. 1） 辣根過氧化物酶-DAB法: ①DAB顯色液的配製:按照1mlH2O加顯色劑A,B,C各1滴,混勻. ②顯色:將適量DAB顯色液平鋪在Ab2雜交後的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現明顯的棕褐色蛋白顯色帶 ③終止:用Tris-HCl緩衝(chong) 液或水漂洗雜交膜即可終止反應. 2） 辣根過氧化物酶-ECL法: 增強化學發光（ECL）檢測是利用辣根過氧化物酶催化化學發光物質,生成一種不穩定的中間物質,其衰變時在暗室內(nei) 形成明顯的肉眼可見的化學發光帶,利用X線膠片感光原理,將結果記錄下來: ECM顯色劑配製:按mlH2O加顯色劑A、B各1滴,混勻. 在暗室將雜交後印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液,月1-5分鍾 用紙巾吸去印跡膜邊緣或者邊角部分多餘(yu) 的顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,並確定幹的表麵與(yu) 膠片接觸. 將印跡膜在暗室中使膠片暴光1-5分鍾,衝(chong) 洗膠片以確定所測抗原的正確暴光時間,暴光時間可短至幾秒也可以長到數小時. 衝(chong) 洗膠片步驟:先在顯影液中衝(chong) 洗至膠片上出現條帶或者膠片透明為(wei) 止,在放入定影液中漂洗,十秒即可. 注意事項: 1. 免疫印跡雜交的敏感與(yu) 檢測係統有關(guan) .因此,凝膠電泳時的蛋白上樣量應該保證被檢測抗原量不至於(yu) 太低,如果過低應該重新純化和濃縮使用,或者建議做一次梯度稀釋,上樣電泳後,直接考馬斯亮藍染色選擇*上樣量,純化和濃縮的蛋白質樣品必須注意鹽的濃度過高,可平衡一下鹽的濃度,如,透析. 2. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度,激活劑的濃度適當,不僅(jin) 可以決(jue) 定凝膠聚合的速度,也將影響凝膠的質量,聚膠時的溫度也將影響凝膠聚合的速度.因此,建議要根據不同溫度下適量增減激活劑的用量以保證分離膠從(cong) 加入激活劑起至開始出現凝膠凝聚的時間為(wei) 15-20分鍾*,對於(yu) 濃縮膠*聚合時間為(wei) 8-10分鍾開始可見聚合.灌完分離膠加水封閉分離膠與(yu) 外界氧氣的結合. 3. 未聚合的丙烯酰胺具有神經毒性,操作時應該戴手套防護.梳子插入濃縮膠時,應確保沒有氣泡,可將梳子稍微傾(qing) 斜插入以減少氣泡的產(chan) 生,梳子拔出來時應該小心,不要破壞加樣孔,如有加樣孔上的凝膠歪斜可用枕頭插入加樣孔中糾正但要避免枕頭刺入膠內(nei) . 4. 電泳槽內(nei) 加入電泳緩衝(chong) 液衝(chong) 洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺,同時建議低電壓短時間的預電泳,清除凝膠內(nei) 的雜質,疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通（恒壓10-20V,20-30min） 5. 加樣前樣品應先離心,尤其是長時間放置的樣品,以減少蛋白質帶的拖尾現象 6. 為(wei) 避免邊緣效應,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩衝(chong) 液 7. 樣品緩衝(chong) 液中煮沸的樣品可在-20℃存放數,,但是反複凍融會(hui) 使蛋白質降解 8. 為(wei) 減少蛋白質條帶的擴散,上樣後應盡快進行電泳,電泳結束後也應直接或者轉印. 9. 上樣時,小心不要使樣品溢出而汙染相臨(lin) 加樣孔 10. 取出凝膠後應注意分清上下,可用刀片切去凝膠的一角作為(wei) 標記（如左上角）轉膜時也應用同樣的方法對NC膜做上標記（如左上角）以分清正反麵和上下關(guan) 係. 11. 轉膜時應依次放好NC膜與(yu) 凝膠所對應的電極,即凝膠對應負極,NC膜對應正極.