熒光探針Fluo-3/AM和FuraRed測量單細胞中比率鈣

熒光探針Fluo-3/AM和FuraRed測量單細胞中比率鈣     中國醫學物理學雜誌1999年第3期第16卷實驗研究作者：馬曉冬朱曉亮趙　清張　瑾張　颯雷國華黃行許鮑永耀單位：馬曉冬趙　清張　瑾張　颯雷國華黃行許鮑永耀（*軍(jun) 醫大學中心實驗室）；朱曉亮（南方醫院皮膚科,廣東(dong) 廣州510515）關(guan) 鍵詞：激光掃描共聚焦顯微鏡；Fluo-3/AM；FuraRed；比率鈣...   摘要：應用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM簡稱共焦顯微鏡）和鈣離子指示劑Fluo-3/AM 、FuraRed熒光探劑雙標記技術，測定了單個(ge) 活細胞內(nei) 比率鈣的動態變化。結果顯示37 ℃, Fluo-3/AM濃度10 μmol/L，FuraRed濃度10 μmol/L的條件下，昆明小鼠巨噬細胞負載1 h左右即可獲良好的標記效果。用比率探針測量細胞內(nei) Ca2+的動態變化，使Ca2+的定性定量測定不受染料濃度、細胞大小、照射光強度以及一定程度的光漂白和染料泄漏等因素的影響，提供了一種準確定性定量細胞內(nei) Ca2+的實時、動態、原位變化的新方法。 　　中圖分類號：Q74　文獻標識碼：A　　文章編號：1005-202X（1999）03-0180－03 Ratiometric calcium measurements in single cells with visible wavelength probes fluo-3/AM and furared MA Xiao-donget al. 　　First Military Medical University,Central Laboratory,, 　　ZHU Xiao-liang 　　Department of Dermatology of Nanfang Hospital , Guangzhou 510515,China 　　Key words：laser scanning confocal microscope ; fluo-3/AM; furared; ratiometric calcium. 　　細胞內(nei) 遊離Ca2+不僅(jin) 作為(wei) 一種重要的第二信使廣泛參與(yu) 細胞的運動、分泌、代謝和分化等多種細胞功能活動的調節[1]；而且胞內(nei) 遊離Ca2+濃度的變化與(yu) 調控對於(yu) 參與(yu) 維持存在於(yu) 細胞質膜或細胞器膜兩(liang) 側(ce) 的跨膜Ca2+梯差，介導細胞對外界刺激的應答反應具有重要的調節作用[2-4]。因此，在完整細胞上準確測定胞內(nei) 遊離Ca2+濃度的動態變化，其重要性是顯而易見的。本文利用ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM），采用單激發單發射指示劑Fluo-3/AM和FuraRed雙標記法測定了外源性刺激劑地塞米鬆誘導胞漿遊離Ca2+的動態變化，獲得了良好的測定效果。 　　1　材料與(yu) 方法 1.1　材料 　　（1）試劑：①地塞米鬆，用不含Ca2+、Mg2+的PBS緩衝(chong) 液配製，RPMI1640培養(yang) 基（Gibco， 德國），小牛血清（Gibco,德國）。②Fluo-3/AM（biotium公司） 、FuraRed（Molecular Probes Inc,USA）用二甲基亞(ya) 碸配成1 mmol/L，置於(yu) -20℃冰箱保存，PluronicF-127（biotium公司）。③不含Ca2+、Mg2+的PBS緩衝(chong) 液（g/L）: 8.01 gNaCl、Na2HPO4.12H2O、0.23 g NaH2PO4.2H2O。④Hepes緩衝(chong) 液。⑤昆明種雄性小鼠（*軍(jun) 醫大學動物所提供）腹腔巨噬細胞培養(yang) 。 　　（2）儀(yi) 器：ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡（Meridian,USA） 　　1.2　方法 　　（1）巨噬細胞培養(yang) 　　18～20 g雄性昆明小鼠，按1次/天，1 ml/次連續三天腹腔注射1%巰基乙醇酸鈉，停一天，按鄂征等人的方法取腹腔巨噬細胞（台酚蘭(lan) 吞噬實驗顯示99％為(wei) 巨噬細胞），以1×106個(ge) /ml接種於(yu) 特製的Petri培養(yang) 皿（Meridian，USA）,用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yang) 於(yu) 37℃，含5％CO2孵箱內(nei) 。2 d後即可進行實驗。 　　（2）熒光探針標記 　　將培養(yang) 2 d的小鼠腹腔巨噬細胞用Hepes緩衝(chong) 液漂洗3次，滴入終濃度為(wei) 10 μmol/L的Fluo-3/AM 和FuraRed，加入1 μl 25％ pluronic F-127，在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育1 h，其間輕輕振蕩幾次，經Hepes緩衝(chong) 液漂洗2次後，再滴入Hepes液0.5 ml。 　　（3）Ca2+動態變化的LSCM測定 　　LSCM由共聚焦顯微鏡主體(ti) ，激光器（Ar+激光）和微型計算機構成。激光束的掃描與(yu) 控製以及圖像數據的采集和加工均由計算機完成。將標記好熒光探劑Fluo-3/AM和FuraRed的小鼠腹腔巨噬細胞，放入激光掃描共聚焦顯微鏡測定小室，用裝有Olympus 　　IMT-2倒置相差顯微鏡和40×物鏡ACAS570激光掃描共聚焦顯微鏡係統掃描成像。用488 nm氬離子激光同時激發兩(liang) 種染料，用ACAS570多彩色濾光盤（Molti-Color Filter Wheel）提供的530/30 nm帶通濾光器和605 nm長通濾光器將兩(liang) 者的發射光分開，用有增輝電路的DageCCD攝像機，以1.0秒的間隔記錄。數據通過圖像采集器直接送入計算機，然後用ACAS570-IQ分析軟件分析。 2　結果 　　（1）用外源性刺激劑地塞米鬆測得巨噬細胞中Fluo-3和FuraRed對細胞內(nei) Ca2+的熒光強度變化曲線。在本實驗中，將地塞米鬆（終濃度為(wei) 1.5μM）加到巨噬細胞培養(yang) 液中（100sec後），引起細胞內(nei) Ca2+迅速增加，隨後逐漸達到平台。兩(liang) 種染料的熒光強度動態變化曲線清楚的表明，加地塞米鬆時（100sec）引發Fluo-3熒光急劇增強，同時伴有FuraRed熒光減弱，提示Ca2+增加（圖1）。在加地塞米鬆前和Ca2+反應的峰值時，兩(liang) 種染料的相對熒光強度以灰度圖表示（圖2）。   　　圖1　地塞米鬆刺激後，小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM和FuraRed的熒光強度變化曲線檢測器1（Det1）Fluo-3/AM通過530/30nm帶能濾光器後單激發的熒光強度變化曲線檢測器2（Det2） FuraRed 通過605 nm長通濾光器後單激發的熒光強度變化曲線 （上圖） （下圖） 　　圖2　地塞米鬆處理前，小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（上圖）和處理後小鼠腹腔巨噬細胞負載Fluo-3/AM、FuraRed的熒光灰度圖像（下圖）。檢測器1（Detector1）表示負載Fluo-3/AM。檢測器2（Detector2）表示負載FuraRed。　　（2）為(wei) 了定量熒光變化，按實驗中每個(ge) 時間點求得Fluo-3/AM探針發射強度與(yu) FuraRed探針發射強度的比率。巨噬細胞對地塞米鬆反應的動態變化曲線表明，熒光比率迅速增加1.2倍，隨後逐漸達到飽和狀態（圖3）。   　圖3　地塞米鬆處理後，小鼠腹腔巨噬細胞負載 　　 Fluo-3/AM、FuraRed的比率熒光動態變化曲線 3　討論 　　（1）在比率法中用兩(liang) 種染料同時標記，需要其比率在細胞內(nei) Ca2+濃度不變時保持穩定。兩(liang) 種染料的泄漏、區域化分布、漂白或代謝等均能導致實驗過程中比率不穩定。Fluo-3/AM和FuraRed都對光漂白敏感，對經過10 μmol/LFluo-3/AM和10 μmol/LFuraRed孵育的巨噬細胞連續掃描，在本實驗中地塞米鬆處理之前兩(liang) 種染料熒光強度的基線值（圖1）及其比率熒光強度的基線值（圖3）都是穩定的。這些結果表明：巨噬細胞中染料無預先發生的光漂白或泄漏；Fluo-3/AM和FuraRed用在比率法中是可行的。 　　（2）FuraRed是近年來研製的一種*的Ca2+指示劑，發射640nm波長的熒光，熒光強度隨FuraRed與(yu) Ca2+結合的增加而減弱[5,6]。相反Fluo-3發射530nm較短波長的熒光，熒光強度隨Fluo-3/AM與(yu) Ca2+結合的增加而增強[7,8]。據此提供了一種定量細胞內(nei) Ca2+可見光激發的比率方法：將Fluo-3/AM和FuraRed聯合使用，用488nm的可見光（激光）激發，來測定細胞內(nei) 比率Ca2+的實時、動態變化。由於(yu) 這兩(liang) 種染料與(yu) Ca2+結合發出的熒光量呈相反的變化，所以增加了對Ca2+檢測的靈敏度。 　　（3）Fluo-3/AM和FuraRed都是很好的Ca2+指示劑。聯合使用兩(liang) 種指示劑，用單一可見光激發能為(wei) 用比率法測量細胞內(nei) 比率Ca2+提供一種*的有價(jia) 值的方法。類似的比率測定法還有很多，如用兩(liang) 種染料同時測量Ca2+和pH[5,9]。但這些方法需要兩(liang) 種不同的熒光探針，而且須特別注意染料負載、光漂白和染料泄漏，每一種因素在各次實驗之間可能明顯地影響比率。使用Fluo-3/AM和FuraRed能提供一種Ca2+測量方法並具有可見光激發的優(you) 點。 　　參考文獻： 　　[1] Capham D E. Cell, 1995，80: 259 . 　　[2] Yang F Y, Tu Y P. Biochem Biophys Res Commun, 1991，175: 366. 　　[3] Fan G F, Huang Y G, Bai Y H, et al. FEBS Lett, 1995，357: 13. 　　[4] Yang X Y, Fan G F, Huang Y G, et al. Chin Sci Bull, 1996; 41: 338. 　[5] Haugland R P. （1992） Molecular probes Catalog. 　　[6] Durebayashi N, Harkins A B, and Baylor S M. Biophysical J, 1992， 61: A160. 　　[7] Minta A, Kao J P Y, and Tsien R Y. Biol Chem, 1989，264: 8171. 　　[8] Kao J P Y, Harootunian A T, and Tsien R Y. Biol Chem, 1989，264: 817. 　　[9] Rijkers G T , Justement L R, Griffeoen A W, and J. C. Cambier Cytometry, 1990，11: 923.