激光掃描共焦顯微鏡原理及其應,細胞上的定位很漂亮

激光掃描共焦顯微鏡（LSCM）是八十年代問世的一種新型分析儀(yi) 器，由於(yu) 其高分辨率，高靈敏度，高放大率等特點，在細胞水平上能作多種功能測量和分析，成為(wei) 分析細胞學的重要研究工具，激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測係統而形成的新型顯微鏡。它對活細胞分層掃描後得到光學切片，可進行細胞三維重建。測量分析細胞形態學參數和熒光強度。利用熒光探針標記LSCM可以對細胞內(nei) 微細結構和離子的動態變化進行定性、定量、定時和定位分析。LSCM可以進行顯微手術，細胞分選，細胞胞間通訊和膜的流動性等測量。它的應用前景非常廣泛，將為(wei) 生物醫學和生命科學領域的科研工作提供新的手段。 激光掃描共焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM），有時也被稱為(wei) 激光掃描細胞儀(yi) （Laser Scanning Cytometer，LSC）是八十年代迅速發展起來的用於(yu) 分析細胞學的新型儀(yi) 器。LSCM與(yu) 普通光學顯微鏡相比優(you) 點明顯，分辨率、靈敏度、放大率和熒光檢測信噪比大大提高。對活細胞可以做分層掃描後，進行三維重建和測量分析，對細胞內(nei) 微細結構的動態變化可進行定性、定量、定時和定位分析檢測，可通過熒光標記檢測細胞內(nei) 離子濃度的變化比例及動態變化。因此LSCM是細胞神經生物學和生理學，藥物學及遺傳(chuan) 學等生物醫學領域的新一代研究工具。 1．LSCM的發展簡況 Simple development of laser scanning confocal microscope 激光掃描共焦顯微鏡是在顯微鏡基礎上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測係統而形成的新型顯微鏡。1971年美國Davidovits和Egger發明了以激光為(wei) 光源的透鏡掃描係統，1978年Sheppard等推出了載物台掃描裝置。1979年有了樣品掃描裝置，1980年Koestert等介紹了鏡掃描係統，1983到1986年，Aslund和Carlsson等介紹了雙鏡掃描係統和共軛聚焦成象係統。1984年*台LSCM實用產(chan) 品問世，十多年來LSCM的應用有了飛速發展。我國在1990年引進五台LSCM，到了1997年已有了三十多台設備。產(chan) 品主要來自四家公司，美國的Bio－Rad和Meridian公司，德國的Zeiss和Leica公司。 2．LSCM的基本原理 Principle of laser scanning confocal microscope 普通光學顯微鏡使用的鹵素燈光源為(wei) 混合光，光譜範圍寬，成象時樣品上每個(ge) 照光點均會(hui) 受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的幹擾，影響成象質量，LSCM結構上采用雙針孔（Pinhole）裝置，形成物象共軛的*設計，激光經物鏡焦平麵上針孔形成點光源對樣品掃描，於(yu) 測量透鏡焦平麵的探測針孔處經空間濾波後，有效地抑製同焦平麵上非測量光點形成的雜散熒光和樣品不同焦平麵發射來的幹擾熒光。這是因為(wei) 光學係統物象共軛，隻有物鏡焦平麵上的點經針孔空間濾波才能形成光點圖象，掃描後可得到信噪比*的光學橫斷麵，分辨率比普通光學顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為(wei) 激光，單色性好，基本消色差，成象聚焦後焦深小，縱向分辨率高，可無損傷(shang) 地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度測量，不同焦平麵的光學切片經三維重建後能得到樣品的三維立體(ti) 結構，這種功能被形象的稱為(wei) "顯微CT"。 3．LSCM的結構特點 Structure of laser scanning confocal microscope LSCM由顯微鏡光學係統，激光光源，掃描裝置和檢測係統構成，整套儀(yi) 器由計算機控製，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平台界麵中方便靈活地進行。常用計算機為(wei) 奔騰係列，內(nei) 存是64MB，以便於(yu) 圖像的存取和運算，軟件界麵多數為(wei) Windows或Windows NT，後者圖象采集效率更高，軟件也可在互聯網上方便地更新。 3.1 顯微鏡光學係統 顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guan) 係到係統的成象質量。通常有倒置和正置兩(liang) 種形式，前者在活細胞檢測等生物醫學應用中使用更廣泛。顯微鏡光路以無限遠光學係統為(wei) 佳，可方便地在其中插人光學選件而不影響成象質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑平場複消色 差物鏡為(wei) 好，有利於(yu) 熒光的采集和成象的清晰。物鏡組的轉換，濾色片組的選取，載物台的移動調節，焦平麵的記憶鎖定都應由計算機自動控製。多功能顯微鏡以德國的蔡司Zeiss和萊卡Leica的產(chan) 品為(wei) 好，也常用日本的尼康Nikon或奧林巴斯Olympus產(chan) 品。 3.2 掃描裝置LSCM使用的掃描裝置有兩(liang) 類，台掃描係統和鏡掃描係統。現在也有兩(liang) 者結合使用的儀(yi) 器。台掃描通過步進馬達驅動載物台，位移精度可達0.lμm，能夠有效地消除成象點橫向象差，使樣品信號強度不受探測位置的影響，可準確定位定量地掃描檢測視野中每一物點的光強度，缺點是載物台機械移動、圖象采集速度較慢。鏡掃描有雙鏡掃描和單鏡掃描兩(liang) 種，通轉鏡完成對樣品的掃描。由於(yu) 轉鏡隻需偏轉很小角度就能涉及很大的掃描範圍，圖象采集速度大大提高，512×512畫麵每秒可達4幀以上，有利於(yu) 那些壽命短的離子作熒光測定，但因光路略有偏轉會(hui) 對通光效率和象差有所影響。掃描係統的工作程序由計算機自動控製。 3.3 激光光源 LSCM使用的激光光源有單激光和多激光係統。氪氬離子激光器是可見光範圍內(nei) 使用的多光譜激光，發射波長488nm、568nm和647nm分別為(wei) 藍光、綠光和紅光，大功率氬離子激光器是紫外和可見光混合激光器，發射波長為(wei) 351－364nm、488nm和514nm分別為(wei) 紫外光、藍光和綠光，單個(ge) 激光優(you) 點是安裝方便，光路簡單，但價(jia) 格較貴並存在不同激光之間的光譜競爭(zheng) 和色差校正問題。多激光器係統在可見光範圍使用氬離子激光器，發射波長為(wei) 488nm和514nm的藍綠光，氦氖激光器發射波長為(wei) 633nm的紅光，紫外光選用氬離子激光器，波長為(wei) 351－364nm。其優(you) 點是各譜線激光單獨發射，不存在譜線競爭(zheng) 的幹擾，調節方便，但光路複雜，光學係統共軸準直調試要求高。1996年新型雙光子激光器問世，利用雙光子倍頻效應，使用可見光激光來代替紫外激光作激發光源達到檢測紫外探針的目的。雙光子激光能使活體(ti) 細胞熒光損傷(shang) 減少，成象質量改善，增強對樣品深層的觀察能力。通過計算機控製的聲光調製器可進行各波長光譜之間高速切換以及迅速改變激光光斑、強度和照明時間。 3.4 檢測係統 LSCM為(wei) 多通道熒光采集係統，光路上要求至少有三個(ge) 熒光通道和一個(ge) 透射光通道，如有第四熒光通道更好，可對物體(ti) 進行多譜線激光激發，樣品發射熒光的探測器為(wei) 感光靈敏度高的光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉換器，可以做光子計數。每個(ge) PMT前設置單獨的針孔，由計算機軟件調節針孔大小，光路中設有能自動切換的濾色片組，滿足不同測量的需要。通過在線視頻打印機或數字照相機可以實時拷貝圖象和製作幻燈。 4．LSCM的生物醫學應用 Application of laser scanning confocal microscope in biomedicine LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數，提供了光學顯微鏡無法顯示的結構，使細胞生物學研究上了一個(ge) 台階。目前我們(men) 可以在亞(ya) 細胞水平進行動態實驗，檢測細胞生物質和離子通道的變化，觀察細胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產(chan) 生的快速反應，進行定性、定量、定時和定位的分析測量。zui常用的功能是細胞三維重建，細胞熒光檢測和細胞顯微操作等。 4.1 細胞的三維重建（3-D Reconstruction） 普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖象結構為(wei) 多層麵的圖象迭加，結構不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向對細胞進行分層掃描，得到一組光學切片，經A／D轉換後作為(wei) 二維數組貯存。這些數組通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色圖象處理，雙色圖象處理，組合成細胞真實的三維結構。旋轉不同角度可觀察各側(ce) 麵的表麵形態，也可不同的斷麵觀察細胞內(nei) 部結構，測量細胞的長寬高、體(ti) 積和斷層麵積等形態學參數。通過模擬熒光處理算法，可以產(chan) 生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體(ti) 感。通過角度旋轉和細胞位置變化可產(chan) 生三維動畫效果。LSCM的三維重建廣泛用於(yu) 各類細胞骨架和形態學分析，染色體(ti) 分析，細胞程序化死亡的觀察，細胞內(nei) 細胞質和細胞器的結構變化的分析和探測等方麵。 4.2 細胞定量熒光測定 顯微熒光光度計由於(yu) 顯微鏡和激發光源的限製成象模糊，隻能測定細胞內(nei) 的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為(wei) 光源，對細胞分層掃描，單獨測定，經積分後能得到細胞熒光的準確定量，重複性。它適於(yu) 活細胞的定量分析，可測定細胞內(nei) 溶酶體(ti) 、線粒體(ti) 、DNA含量、RNA含量、酶和結構性蛋白質等物質含量和分布，常用於(yu) 原位分子雜交，腫瘤細胞識別，單個(ge) 活細胞水平的DNA損傷(shang) 及修複的定量分析。它適於(yu) 快速高靈敏度測量，減少光粹滅的影響，在定量免疫熒光測定方麵應用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達的定量分析，監測腫瘤相關(guan) 抗原表達的定位定量信息，監測藥物對肌體(ti) 免疫功能的作用，監測自身免疫性疾病的多種抗原及藥物對肌體(ti) 免疫功能的作用，監測細胞結合和殺傷(shang) 的形態特征並作定量分析等。細胞定量熒光測定可選用單熒光。雙熒光和三熒光方式，能自動測定細胞麵積，平均熒光強度，積分熒光強度及形狀因子等多種參數。 4.3 細胞內(nei) 鈣離子PH值和其它離子的動態分析 通過Indo－1、Fluo－2、Fluo－3、Calcium green、SNARF等多種熒光探針，可對細胞內(nei) 鈣離子、鈉離子及PH值等作熒光標記並對它們(men) 進行比率值和濃度梯度變化測定。由於(yu) 細胞內(nei) 鈣離子為(wei) 傳(chuan) 遞信息的第二信使，對細胞生長分化起著重要作用，通過單標記或雙標記對細胞內(nei) 鈣離子和其它離子的熒光強度和分布測定，測定樣品達到毫秒級的快速變化。借助光學切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細胞光學切片的生物化學特性的變化。通過不同時間段的檢測可測定細胞內(nei) 離子的擴散速率，了解它對腫瘤啟動因子、生長因子等刺激的反應。細胞內(nei) 離子測量廣泛用於(yu) 腫瘤研究、組織胚胎學、細胞生物學和藥理學等領域。 4.4 細胞胞間通訊（Cell Communication）和膜的流動性 動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通訊在細胞增殖和分化中起著重要作用。通過測量細胞縫隙連接分子的轉移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑製作用及細胞內(nei) 鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，並監測環境毒素和藥物在細胞增殖和分化中所起到的作用。選定經熒光染色後的細胞，借助於(yu) 光漂白作用或光損傷(shang) 作用使細胞部分或整體(ti) 不發熒光，實時觀察檢測熒光的恢複過程，可直接反應細胞胞間通訊結果。 細胞膜的流動性在進行膜的磷脂酸組成分析，藥物作用點和藥物作用效應，測定溫度反應和物種比較方麵有重要作用。細胞膜熒光探針受到極化光線激發後，發射光極性依賴於(yu) 熒光分子的旋轉，這種有序的運動自由度取決(jue) 於(yu) 熒光分子周圍的膜流動性，所以極性測量能間接反映細胞膜的流動性。 4.5 熒光光漂白恢複（Fluorescence Redistribution After Photo bleaching，FRAP） FRAP是用來測定活細胞的動力學參數，借助於(yu) 高強度脈衝(chong) 激光來照射細胞某一區域，造成該區域熒光分子的光粹滅，該區域周圍的非粹滅熒光分子會(hui) 以一定的速率向受照射區域擴散，這個(ge) 擴散速率可通過低強度激光掃描探測,因而可得到活細胞的動力學參數。LSCM可以控製光粹滅作用，實時監測分子擴散率和恢複速率，反映細胞結構和活動機製。廣泛用於(yu) 研究細胞骨架構成，核膜結構跨膜大分子遷移率，細胞間通訊等領域。 4.6 籠鎖-解籠鎖測定（Caged-Uncaged） 這是一種光活化測定功能。生物活性產(chan) 物或其它化合物處於(yu) 籠鎖狀態時，其功能封閉，一旦被特異波長的瞬間光照射後，產(chan) 生光活化解籠鎖，恢複原有的活性和功能，在細胞增殖分化等生物代謝過程中發揮功能。LSCM可以控製籠鎖探針的瞬間光分，選取特定的照射時間和波長，從(cong) 而達到人為(wei) 控製多種活性產(chan) 物和其它化合物在生物代謝中發揮功能的時間和空間作用。它們(men) 包括第二信使、核甘酸、神經介質、鈣離子。 4.7 粘附細胞分選（Adhered Cell Sort）和顯微手術（Micro-operation） 采用台掃描方式的LSCM，由於(yu) 激光束固定在顯微鏡的光軸上，可對載物台上的樣品作地定位掃描，從(cong) 而對所要選擇的細胞進行分選，Meridian公司的LSCM能夠理想地進行這項工作，在不改變細胞培養(yang) 周圍環境，細胞鋪展程度和生長狀態情況下進行細胞分選。分選方法有兩(liang) 種，一種是光刀切割法（Cookie－Cutter），將細胞貼壁培養(yang) 在特製培養(yang) 皿上，利用高能激光在所選細胞周圍作八角形切割，隻在其間保留所選細胞，選擇條件取決(jue) 於(yu) 特定熒光和細胞形態學參數，這種分選方法特別適用於(yu) 選擇數量較少的細胞，如突變細胞、轉移細胞和雜交瘤細胞等。第二種方法是激光消除法（Laser Ablation），用高能量激光自動殺滅不需要的細胞，留下完整的活細胞亞(ya) 群繼續培養(yang) ，這種方式取決(jue) 於(yu) 細胞熒光特性，特別適於(yu) 對數量較多的細胞選擇。 通過這兩(liang) 種方式可以總體(ti) 掃描細胞群，進行細胞物理和生化特性的選擇。能對百萬(wan) 分之一機率發生突變的細胞作篩選，能不改變細胞類型、形態和活性而克隆細胞，能分離細胞亞(ya) 群並進行定量熒光檢測，能存儲(chu) 細胞位置對特定細胞重複測定。這種細胞分選方式效率和度都很高。 借助LSCM我們(men) 可以把激光作為(wei) 光子刀應用，來完成細胞膜瞬間打孔，線粒體(ti) 、溶酶體(ti) 和染色體(ti) 的切割，以及神經元突起切割等顯微細胞外科手術。 4.8 激光光陷阱技術（Optical trap） 激光光陷阱技術又稱為(wei) 光攝技術，就是利用光學梯度力形成的光陷阱，產(chan) 生具有傳(chuan) 統機械鑷子挾持和操縱微小物體(ti) 的功能。當微米級範圍的顆粒落人一個(ge) 非均勻光場中，它將趨於(yu) 特定的平衡位置，如果沒有外界強有力的幹擾，物體(ti) 不會(hui) 偏離光學中心。由於(yu) 外界作用和粒子自身運動等原因產(chan) 生的中心偏離也會(hui) 很快恢複原位，光造成一個(ge) 勢能較低的陷阱區域，當物體(ti) 的動能不能克服周圍勢壘時，它將留在陷阱內(nei) 。這種固定是光子動量的結果，與(yu) 照明強度和波長直接有關(guan) 。較大物體(ti) 比較小的結構需要更多的陷阱能量。光攝可以在保持處在生產(chan) 環境中的細胞仍可與(yu) 外界溝通的條件下，對目標細胞進行非接觸式的捕獲與(yu) 固定，井進行地操作，克服了以往單細胞操作中細胞難以固定和易產(chan) 生機械損傷(shang) 的弱點。這項新技術廣泛應用於(yu) 染色體(ti) 移動，細胞器移動，細胞骨架彈性測量，細胞周期和調控研究及分子動力原研究等方麵，尤其是在探測植物細胞骨架時，光陷阱是目前能探測其彈性和流變性的*技術。 綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由於(yu) 其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能測量和分析，成為(wei) 分析細胞學的一項重要研究手段。目前LSCM價(jia) 格一般報價(jia) 為(wei) 150萬(wan) 至300萬(wan) 左右，用戶基本集中在中科院係統和高等院校，隨著LSCM設備和應用技術的不斷完善，它在生物醫學和生命科學領域裏將起到更重要的作用，應用前景非常廣泛激光掃描共焦顯微鏡技術的應用 應用 ： •  定位、定量 •  三維重組 •  動態測量 ¨ 活細胞或組織內(nei) 遊離Ca2+濃度的測量 ¨ 活細胞內(nei) H+濃度（ pH值）的測量 ¨ 自由基的檢測 ¨ 藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量 •  細胞膜電位的測量 •  熒光漂白恢複（FRAP）的測量 •  籠鎖解籠鎖的測量 •  熒光能量共振轉移（FRET）的測量 •  其他應用 一.定位、定量 •  免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量 如：細胞膜受體(ti) 或抗原的分布， 微絲(si) 、微管的分布、 兩(liang) 種或三種蛋白的共存與(yu) 共定位、蛋白與(yu) 細胞器的共定位 •  細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI •  末端原位雜交-fitc + PI •  熒光原位雜交： 染色體(ti) 基因定位 •  單細胞凝膠電泳 •  GFP的表達 •  遊離Ca2+ 的分布與(yu) 定量 •  定位、定量研究中常用熒光探針 1.Amine-Reactive Probes 與(yu) 抗體(ti) 耦聯、與(yu) 配體(ti) 耦聯、與(yu) 肽耦聯、與(yu) 人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探針，可用於(yu) 免疫組化、熒光原位雜交、受體(ti) 標記等 FITC （fluorescent isothiocyanate） BODIPY FL 503/512 異硫氰基熒光素 494/518 TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569 Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618 PE 藻紅蛋白 565/578 cy3 490/530 cy5 650/690 1）細胞表麵抗原、胞內(nei) 某種蛋白 免役熒光標記： 與(yu) 抗體(ti) 耦聯, 直標: 一抗+熒光探針 間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體(ti) +熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針 2）細胞膜表麵受體(ti)  配體(ti) +熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(ti) （D1,D2） 標記 Gm1: 霍亂(luan) 毒素受體(ti) 霍亂(luan) 毒素+FITC 2.標記細胞器熒光探針 1）線粒體(ti) Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子性,可檢 測線粒體(ti) 膜電位, 且在多數細胞中停留 時間短 JC1 線粒體(ti) 膜電位低時為(wei) 單體(ti) 490/527 發綠光 線粒體(ti) 膜電位低時為(wei) 多聚體(ti) 490/590 發紅光 可標記活細胞線粒體(ti) ，且為(wei) 檢測線粒體(ti) 膜電 位*探針 Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 , 穩定不漏出 Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, （氧化型） Mitoracker Orange 還原型, 隻能染活細胞 2）溶酶體(ti) Lysosome 中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體(ti) 等酸性器官 為(wei) 非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red 3）內(nei) 質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內(nei) 質網, 較低濃度標記線粒體(ti) 4）高爾基體(ti) Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體(ti) 5）細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞 碘化丙啶 EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞 Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞 Hochest 33258 （同上） DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞 Chromomycin A3 450/470 DNA G-C AO 500/526 DNA 活細胞 460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA   死細胞 SYTO 活細胞 3. GFP 綠色熒光蛋白 GFP的的發現：60年代，Shimomura等首先從(cong) 水母中分離出一種水母發光蛋白（aequoren），該蛋白與(yu) 鈣和腸腔素結合後可產(chan) 生藍色熒光。然而水母整體(ti) 幾提取的顆粒都呈綠色，後經證實在水母體(ti) 內(nei) 還存在另外一種發光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 後經研究表明，在水母體(ti) 內(nei) Ca2+和腸腔素與(yu) 水母發光蛋白結合後，水母發光蛋白產(chan) 生藍色熒光，GFP在藍光的激發下，產(chan) 生綠色熒光 。 將外源基因與(yu) GFP DNA 相連, GFP可作為(wei) 外源基因的報告基因實時監測外源基因的表達. GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察 如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程 中的時空表達 GFP基因與(yu) 分泌蛋白基因連接後轉染細胞, 可動態觀察該 分泌蛋白分泌到細胞外的過程 GFP基因與(yu) 定位於(yu) 某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示 活細胞中細胞核、內(nei) 質網、高爾基體(ti) 、線粒體(ti) 等細胞器的 結構及病理過程 l  定位與(yu) 定量測量應注意的問題 定位： 1.可以對圖像進行修飾， 2.pinhole 可盡可能的小。 3.確認共定位時要取兩(liang) 個(ge) 通道熒光相互幹擾的對照圖像 定量： 1.儀(yi) 器的各個(ge) 條件必須一致 2.必須用原始圖像進行定量測量 3.Pinhole盡可能的大 二.顯微CT與(yu) 三維重組 光切的層數：  VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX 三.動態測量 l  Physiology:細胞內(nei) 離子動態變化測量 1）.遊離Ca2+測量 檢測遊離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為(wei) Ca2+螯合劑，不與(yu) Ca2+結合時不發熒光，通常也不能進入細胞膜，隻有與(yu) 乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內(nei) ，被細胞內(nei) 酯酶水解後並與(yu) 胞內(nei) 遊離鈣結合後發出熒光。Kd值為(wei) Ca2+解離常數，表明檢測Ca2+濃度的範圍:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關(guan) ，如pH、 Mg2+、與(yu) 蛋白的結合、溫度等。細胞內(nei) 生理Ca2+濃度值（10-100n M），細胞內(nei) Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）  熒光探針 激發波長   發射波長 Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm   525nm 390nM     Fluo4       506nm    525nm       Calcium Green-1 507nm   530nm 190nM Calcium Green-2   507nm   535nm 550nM Fura red     420/480nm   637nm 140nM Oregon Green 488   494nm   520nm   20,000nM Calcium Crimson   583nm   602nm 328nM Indo-1     356nm 405/458nm 230nM Fura-2       340/380 476nm 145nM l  相對 測量           DF/F=（F-Fbase）/（Fbase-FBG） l  Ca2+濃度測量 l  單波長公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd（F-Fmin）/（Fmax-F） Fmin: 細胞內(nei) 無鈣時的熒光強度（ MnCl2） Fmax：細胞內(nei) 鈣飽和時的熒光強度（A23187） •  測量時切記細胞內(nei) 靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低於(yu) 40） 細胞內(nei) 生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nei) Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右） ·  標準曲線法 根據儀(yi) 器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer（EGTA- Ca2+）做標準曲線，橫軸為(wei) Ca2+濃度，縱軸為(wei) 熒光強度 ·  比例熒光的測量 .雙波長（比例熒光：ratio） Indo1（360, 420/480）, fura2（340/380, 440） [Ca2+]I =Kd（R-Rmin）/（Rmax-R）Ff2/Fs2 •  細胞器的Ca2+測量 1.線粒體(ti) 內(nei) 遊離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM（線粒體(ti) 熒光探針，紅色） 2. 特異定位的重組水母發光蛋白 水母發光蛋白與(yu) Ca2+結合後發藍光 用含有水母發光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體(ti) 轉染細胞，可測定亞(ya) 細胞器內(nei) 的遊離Ca2+變化   目前已商品化的探針可檢測：線粒體(ti) 、內(nei) 質網、細胞核內(nei) 的遊離Ca2+，因生物發光很弱不能使用Confocal檢測 細胞內(nei) 遊離Ca2+測量的應用 l  鈣的特性 1．細胞內(nei) 外的電化學梯度103-104倍 2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內(nei) 鈣 明顯升高 3．細胞內(nei) 鈣為(wei) 細胞激活“開關(guan) ” l  細胞內(nei) 鈣的生理作用 1．肌肉的興(xing) 奮收縮-收縮偶聯 2．神經遞質的釋放 3．學習(xi) 記憶的增強 4．卵子受精 5．細胞分裂和再生 6．細胞調亡 7．細胞間通訊 8．細胞信號傳(chuan) 導 9. DNA合成 10. 基因表達 l  細胞內(nei) 鈣超載與(yu) 疾病 1．高血壓、腦缺血、心髒病、內(nei) 分泌病—胞內(nei) 鈣濃度異常 2．糖尿病、風濕性關(guan) 節炎、多發性硬化病—胞內(nei) 鈣濃度增高 3．人體(ti) 缺鈣—骨鈣大量丟(diu) 失，神經細胞的鈣濃度增高 4．老化和老年性癡呆-神經細胞內(nei) 鈣濃度增高 細胞內(nei) 生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nei) Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右） 五.熒光漂白恢複（FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定義(yi) :經熒光探針標記的細胞的某一區域一旦被高強度的 激光照射後,熒光物質的光化學結構被迫壞,熒光強度 下降, 且為(wei) 不可逆的過程, 但此處熒光強度會(hui) 漸漸恢 複, 熒光強度和恢複的快慢和多少,代表周圍分子擴散 的速率, 或分子運動速度。 R=（I2-I1 /I0-I2）´100% R-熒光漂白恢複率：代表分子的運動速度 應用：細胞間通訊， 細胞膜流動性，蛋白分子的運動 六.籠鎖解籠鎖的測量 定義(yi) ：籠鎖化合物全稱為(wei) 光致不穩定籠鎖化合物，為(wei) 人工合成的用隱蔽基團修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩(liang) 者間的共價(jia) 鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為(wei) 解籠鎖。   籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經遞質、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等 七．熒光能量共振轉移（ fluorescence Resonance Energy Transfer） 能量轉移：能量從(cong) 分子的一個(ge) 部位向另一個(ge) 部位的傳(chuan) 遞，或能量從(cong) 一個(ge) 分子向另一個(ge) 分子傳(chuan) 遞。能量的提供者叫能量供體(ti) ，能量的接受者叫能量受體(ti) 。 能量共振轉移：分子可以看作為(wei) 正負電荷分離的一個(ge) 偶極子，受激發以一定的頻率振動，如果其附近有一個(ge) 振動頻率相同的另一分子存在，則通過這兩(liang) 個(ge) 分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從(cong) 前者轉移到後者，這種能量轉移稱為(wei) 共振轉移 熒光能量共振轉移的條件 兩(liang) 個(ge) 熒光分子：供體(ti) -FL1，受體(ti) -FL2 供體(ti) 與(yu) 受體(ti) 的距離在2-7nm 供體(ti) 的發射波長與(yu) 受體(ti) 的激發波長一致 l  檢測 以FL1的激發波長的光照射樣品，沒有共振轉移時，隻檢 測到 FL1的發射光（綠光），發生共振轉移時，就可檢測出 FL1的熒光（綠光）減弱，FL2（紅光）的增強。 l  應用：檢測大分子的相互作用 D 大分子構象的改變（蛋白） 例：大分子（亞(ya) 基）的結合與(yu) 分離 D 受體(ti) 與(yu) 配體(ti) 的結合 · 常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP   八 .其它應用 生物材料,例: 細胞在生物材料中的生長狀態及分布