ELISA的精點摘要,不要錯過奧

的試劑，良好的儀(yi) 器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條 件。ELISA的操作因固相載體(ti) 的形成不同而有所差異，國內(nei) 醫學檢驗一般均用板式點。 本文將敘述板式ELISA各個(ge) 操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試 劑均與(yu) 特殊儀(yi) 器配合應用，兩(liang) 者均有詳細的使用說明，嚴(yan) 格遵照規定操作，必能得出 準確的結果。 4.1 標本的采取和保存 　　可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體(ti) 液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物 （如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體(ti) 或抗原成份。有些標本可直接進行 測定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢 測均以血清為(wei) 標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等於(yu) 血清。製 備血漿標本需借助於(yu) 抗凝劑，而血清標本隻要待血清自然凝固、血塊收縮後即可取得。除 特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為(wei) 檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。 血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會(hui) 釋放出具有過氧化物酶活 性的物質，以HRP為(wei) 標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(hui) 增加非特異性顯色。 　　血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌汙染，菌體(ti) 中可能含有內(nei) 源性HRP，也會(hui) 產(chan) 生假 陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。 一般說來，在5天內(nei) 測定的血清標本可放置於(yu) 4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清 融解後，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和， 不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾，澄清後再檢測。反 複凍融會(hui) 使抗體(ti) 效價(jia) 跌落，所以測抗體(ti) 的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰 存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑（見3.2.4）。   4.2 試劑的準備 　　按試劑盒說明書(shu) 的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包 括用於(yu) 洗滌的，應為(wei) 新鮮的和高質量的。自配的緩衝(chong) 液應用pH計測量較正。從(cong) 冰箱中取出 的試驗用試劑應待溫度與(yu) 室溫平衡後使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰 箱保存。   4.3 加樣 　　在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物 加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可產(chan) 生氣泡。 　　加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發 生交叉汙染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的 血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加 入血清標本，然後在微型震蕩器上震蕩1分鍾以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用 液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。   4.4 保溫 　　在ELISA中一般有兩(liang) 次抗原抗體(ti) 反應，即加標本和加酶結合物後。抗原抗體(ti) 反應的完 成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為(wei) 溫育（incubation），有人稱之為(wei) 孵育，在 ELISA中似不恰當。 　　ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體(ti) 的結合隻在固相表麵上發生。以抗體(ti) 包被的夾心 法為(wei) 例，加入板孔中的標本，其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會(hui) ，隻有zui 貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與(yu) 抗體(ti) 接觸。這是一個(ge) 逐步平衡的過程，因此需經擴散 才能達到反應的終點。在其後加入的酶標記抗體(ti) 與(yu) 固相抗原的結合也同樣如此。這就是為(wei) 什麽(me) ELISA反應總是需要一定時間的溫育。 　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用 的保溫溫度，也是大多數抗原抗體(ti) 結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究 時，實驗表明，兩(liang) 次抗原抗體(ti) 反應一般在37℃經1-2小時，產(chan) 物的生成可達。為(wei) 加速 反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體(ti) 反應 4℃更為(wei) *，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成zui多的沉澱。但因所需 時間太長，在ELISA中一般不予采用。 　　保溫的方式除有的ELISA儀(yi) 器附有特製的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA板 置於(yu) 水浴箱中，ELISA板底應貼著水麵，使溫度迅速平衡。為(wei) 避免蒸發，板上應加蓋，也 可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水麵上。若用保溫箱，ELISA 板應放在濕盒內(nei) ，濕盒要選用傳(chuan) 熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui後將 ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的 時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅 速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴(yan) 格限製在規定的範圍內(nei) ，標準室溫溫度是指 20-25℃，但具體(ti) 操作時可根據說明書(shu) 的要求控製溫育。室溫溫育時，ELISA板隻要平置 於(yu) 操作台上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為(wei) 保證這一點，一個(ge) 人操 作時，一次不宜多於(yu) 兩(liang) 塊板同時測定。   4.5 洗滌 　　洗滌在ELISA過程中雖不是一個(ge) 反應步驟，但卻也決(jue) 定著實驗的成敗。ELSIA就是靠 洗滌來達到分離遊離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與(yu) 固 相抗原或抗體(ti) 結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於(yu) 固相載體(ti) 的幹擾物質。聚 苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的幹擾物 質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是zui主要的關(guan) 鍵技術，應引起操作者的高度重 視，操作者應嚴(yan) 格按要求洗滌，不得馬虎。 　　洗滌的方式除某些ELISA儀(yi) 器配有特殊的自動洗滌儀(yi) 外，手工操作有浸泡式和流水衝(chong) 洗式兩(liang) 種，過程如下： 　　（1）浸泡式 a.吸幹或甩幹孔內(nei) 反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔 後，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鍾，間歇搖動，浸泡時間不可隨 意縮短；d.吸幹孔內(nei) 液體(ti) 。吸幹應*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體(ti) 後在清 潔毛巾或吸水紙上拍幹；e.重複操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在間接法中如本 底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。 　　微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為(wei) 含非離子型洗滌劑的中性緩衝(chong) 液。聚苯 乙烯載體(ti) 與(yu) 蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親(qin) 水基團，其 疏水基團與(yu) 蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從(cong) 而削弱蛋白質與(yu) 固相載體(ti) 的結合，並借助 於(yu) 親(qin) 水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回複到水溶液狀態，從(cong) 而脫離固相載體(ti) 。洗滌 液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高於(yu) 0.2%時，可使 包被在固相上的抗原或抗體(ti) 解吸附而減低試驗的靈敏度。 　　（2）流水衝(chong) 洗式 流水衝(chong) 洗法zui初用於(yu) 小珠載體(ti) 的洗滌，洗滌液僅(jin) 為(wei) 蒸餾水甚至可用 自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水衝(chong) 擊下不斷地滾動淋洗，持續衝(chong) 洗2分鍾 後，吸幹液體(ti) ，再用蒸餾水浸泡2分鍾，吸幹即可。浸泡式猶如盆浴，流水衝(chong) 洗式則好比 淋浴，其洗滌效果更為(wei) *，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水衝(chong) 洗式同樣也適用於(yu) 微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流衝(chong) 擊板孔表麵，洗滌效果 更佳。   4.6 顯色和比色 4.6.1 顯色 　　顯色是ELISA中的zui後一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chan) 物。反應 的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nei) ，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時 間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助於(yu) 加速顯色進行。在定量測定中，加入底物後的 反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴(yan) 格 控製，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判 斷。 　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鍾後即不再加深，再延長反應時間， 可使本底值增高。OPD底物液受光照會(hui) 自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時 加入終止液終止反應。OPD產(chan) 物用硫酸終止後，顯色由橙黃色轉向棕黃色。 　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置於(yu) 操作台上，邊反應觀察結果。但為(wei) 保證實驗 結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用後，約40分鍾顯色達頂 峰，隨即逐漸減弱，至2小時後即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十 二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑製劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間 （12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會(hui) 使藍色轉變 成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。   4.6.2 比色 　　比色前應先用潔淨的吸水紙拭幹板底附著的液體(ti) ，然後將板正確放入酶標比色儀(yi) 的比 色架中。以軟板為(wei) 載體(ti) 的試驗，需先將板置於(yu) 標準96孔的座架中，才可進行比色。在 加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪淨，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。 　　比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅(jin) 加底物液的孔）和空白孔 （以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其後可用 空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然後進行計算。 　　比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度 （absorbence，A），兩(liang) 者含義(yi) 相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫(xie) 於(yu) A字母的右下 角，如OPD的吸收波長為(wei) 492nm，表示方法為(wei) "A492nm"或"OD492nm"。   4.6.3 酶標比色儀(yi) 　　酶標比色儀(yi) 簡稱酶標儀(yi) ，通常指於(yu) 測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載 體(ti) 形式的不同，各有特製的適用於(yu) 板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標 儀(yi) 。酶標儀(yi) 的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重複性、度和可測範圍、 線性等等。優(you) 良的酶標儀(yi) 的讀數一般可到0.001，準確性為(wei) ±1%，重複性達0.5%。舉(ju) 例說，若某孔測得的A值為(wei) 1.083，則該孔相對於(yu) 空氣的真實A值應為(wei) 1.083±0.01 （1.073~1.093），重複測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶 標儀(yi) 的可測範圍視各酶標儀(yi) 的性能而不同。普通的酶標儀(yi) 在0.000~2.000，新型號的酶標 儀(yi) 上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應 注意可測範圍與(yu) 線性範圍的不同，線性範圍常小於(yu) 可測範圍，比如某一酶標儀(yi) 的可測範圍 為(wei) 0.000~2.900，而其線性範圍僅(jin) 0.000~2.000，這在定量ELISA中製作標準曲線時應予注 意。 　　酶標儀(yi) 不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀(yi) 器 15-30分鍾，測讀結果更穩定。 　　測讀A值時，要選用產(chan) 物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀(yi) 可用雙波 長式測讀，即每孔先後測讀兩(liang) 次，*次在zui適波長（W1），第二次在不敏感波長 （W2），兩(liang) 次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為(wei) W1，630nm為(wei) W2， zui終測得的A值為(wei) 兩(liang) 者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造 成的光幹擾。 　　各種酶標儀(yi) 性能有所不同，使用中應詳細新聞記者說明書(shu) 。   4.7 結果判斷   4.7.1 定性測定 　　定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體(ti) 作出"有"或"無"的簡單 回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定係統中有反應。"陰性"則為(wei) 無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一 個(ge) 定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一係列稀釋後進行試驗，呈陽性反應的zui高 稀釋度即為(wei) 滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈 色的深淺判斷為(wei) 強陽性、弱陽性更具定量意義(yi) 。 　　在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深於(yu) 陰性孔。在競爭(zheng) 法ELISA中則相反，陰 性孔呈色深於(yu) 陽性孔。兩(liang) 類反應的結果判斷方法不同，分述於(yu) 下。 　　（1） 間接法和夾心法 　　這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近於(yu) 無色者判為(wei) 陰性，顯色 清晰者為(wei) 陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應後常可出現呈色的本底，此本底的深淺因 試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為(wei) 不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結果時，更宜用顯色深於(yu) 陰性 對照作為(wei) 標本陽性的指標。 　　目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可 以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸 光值，然後進行計算。計算方法有多種，大致可分為(wei) 陽性判定值法和標本與(yu) 陰性對照比值 法兩(liang) 類。 　　a． 陽性判定值 　　陽性判定值（cut-off value）一般為(wei) 陰性對照A值加上一個(ge) 特定的常數，以此作為(wei) 判斷 結果陽性或陰性的標準。 　　用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的製備必須標準化，陽性和陰性的對照 品應符合一定的規格，須配用精密的儀(yi) 器，並嚴(yan) 格按規定操作。陽性判定值公式中的常數 是在這特定的係統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉(ju) 某種檢測HBsAg的試劑盒 為(wei) 例。試劑盒中的陰性對照品為(wei) 不含HBsAg的複鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明 為(wei) P=9±2ng/ml。每次試驗設2個(ge) 陽性對照和3個(ge) 陰性對照。測得A值後，先計算陰性對照A 值的平均數（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩(liang) 個(ge) 平均數的差（P-N）必須大於(yu) 一個(ge) 特定的數值（例0.400），試驗才有效。3個(ge) 陰性對照A值均應≥0.5×NCX，並≤1.5 ×NCX，如其中之一超出此範圍，則棄去，而已另兩(liang) 個(ge) 陰性對照重新計算NCX；如有兩(liang) 個(ge) 陰性對照A值超出以上範圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 　　陽性判定值=NCX+0.05 　　標本A值＞陽性判定值的為(wei) 陽性，小於(yu) 陽性判定值的為(wei) 陰性。應注意的是，式中0.05 為(wei) 該試劑盒的常數，隻適合於(yu) 該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。 　　根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用， 試劑變質和操作不當均會(hui) 產(chan) 生"試驗無效"的後果。 　　b.標本/陰性對照比值 　　在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為(wei) 合適。在得出標本 （S）和陰性對照（N）的A值後，計算S/N值。也有寫(xie) 作P/N的，這裏的P不代表陽性 （positive），而是病人（patient）的縮寫(xie) ，不應誤解。為(wei) 避免混淆，更宜用S/N表示。在早 期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為(wei) 陽性標準，現多為(wei) 各種測定所沿用。實際上每一 測定係統應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受 檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為(wei) 不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩衝(chong) 液， 以致反應後產(chan) 生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規，如N<0.05 （或其他數值），則按0.05計算，否則將出現假陽性結果。 　　（2）競爭(zheng) 法 　　在競爭(zheng) 法ELISA中，陰性孔呈色深於(yu) 陽性孔。陰性呈色的強度取決(jue) 於(yu) 反應中酶結合物 的濃度和加入競爭(zheng) 抑製物的量，一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應zui為(wei) 敏感。 　　競爭(zheng) 法ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與(yu) 陰性對照的顯色差 異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩(liang) 種，即陽性判定 值法和抑製率法。 　　a. 陽性判定值法 　　與(yu) 間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照A值， 現舉(ju) 某種檢測抗HBc的試劑盒為(wei) 例。試劑盒中的陰性對照為(wei) 不含抗HBc的複鈣人血漿，陽 性對照中抗HBc含量為(wei) 125±100u/ml。每次試驗設2個(ge) 陽性對照和3個(ge) 陰性對照。測得A值 後，先計算陰性對照A值的平均值（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩(liang) 個(ge) 平均數 的差（N-P）必須大於(yu) 一個(ge) 特定的數值（例如0.300）,試驗才有效。3個(ge) 陰性對照A值均應 小於(yu) 2.000，而且應≥0.5×NCX並≤1.5×NCX，如其中之一超出此範圍，則棄去，而以另 2個(ge) 陰性對照重新計算×NCX；如有2個(ge) 陰性對照A超出以上範圍，則該次實驗無效。陽性 判定值按下式計算： 　　陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX 　　標本A值≤陽性判定值的反應為(wei) 陽性，A＞陽性判定值的反應為(wei) 陰性。 　　b. 抑製率法 　　抑製率表示標本在競爭(zheng) 結合中標本對陰性反應顯色的抑製程度，按下式計算： 　　抑製率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×100%/陰性對照A值 　　一般規定抑製率≥50%為(wei) 陽性，＜50%為(wei) 陰性。   4.7.2 定量測定 　　ELSIA操作步驟複雜，影響反應因素較多，特別是固相載體(ti) 的包被難達到各個(ge) 體(ti) 之間 的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一係列不同濃度的參考標準品在相同的條件 下製作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的範圍一般較寬，曲線zui 高點的吸光度可接近2.0，繪製時常用半對數紙，以檢測物的濃度為(wei) 橫坐標，以吸光度為(wei) 縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨於(yu) 平坦，中央 較呈直線的部分是的檢測區域。甲胎蛋白質ELISA測定的標準曲線示例見圖4-1。 　　測定小分子量物質常用競爭(zheng) 法（參見2.2），其標準曲線中吸光度與(yu) 受檢物質的濃度 呈負相關(guan) 。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線 示例見圖4-2。注意圖中橫坐標為(wei) 對數關(guan) 係，這更有利於(yu) 測定係統的表達。