免疫組化實驗的小竅門

1．固定：用4%的多聚甲醛固定液。對於(yu) 冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對於(yu) 不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體(ti) 會(hui) 有比較適合而推薦的固定液，請於(yu) 購置前注意說明書(shu) 。 Bouin S固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適於(yu) 組織標本的長期保存。 PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適於(yu) 固定石蠟切片。適於(yu) 富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。 2．組織脫水，透明：時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整. 3．切片時展片：有些組織在切片後難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。 4．烤片：60℃ 30分鍾或37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟(diu) 失。 5．蠟塊及切片的保存：在4℃保存 6．脫片問題： Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為(wei) 目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合於(yu) 需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩(liang) 種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鍾，晾幹，即可進行下一步。 7．滅活內(nei) 源性酶：HRP係統：3%雙氧水滅活；AP係統：3%HAc滅活。 8．暴露抗原：對於(yu) 石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修複，這將有助於(yu) 暴露抗原決(jue) 定簇，從(cong) 而增加免疫組化染色的強度（不同抗體(ti) 的*修複液請參閱抗體(ti) 說明書(shu) ）。對於(yu) 不同的組織，不同的抗原，不同的抗體(ti) ，所采用的方法應不一樣，可進行熱修複、胰酶消化、既不修複也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。 9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉 10．抗體(ti) 稀釋：應遵循“現用現配”的原則，對於(yu) PBS稀釋的抗體(ti) 一定要當天使用。 11．背景高：在抗體(ti) 濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。 12．返藍：在蘇木素複染後，可用堿性緩衝(chong) 液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。 13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控製背景。 14．在整個(ge) 操作過程中，切片千萬(wan) 不能幹燥，否則會(hui) 有非特異性染色