質粒提取簡介及問題分析

一、導論 質粒提取的原理:轉自複旦大學一位老師的帖子，後麵是方法介紹 堿裂解法從(cong) 大腸杆菌製備質粒，是從(cong) 事分子生物學研究的實驗室每天都要用的常規技術。可是我收研究生十幾年了，幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什麽(me) 都知道的學生卻對堿法質粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因為(wei) 《分子克隆》裏麵隻講實驗操作步驟，而沒有對原理進行詳細的論述。這是導致我的學生誤入歧途的主要原因。後來我發現其實是整個(ge) 中國的相關(guan) 領域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老師”也是這個(ge) 狀態。這就不得不讓人感到悲哀了。 我想這恐怕和我們(men) 的文化有點關(guan) 係。中國人崇尚讀書(shu) ，“學而優(you) 則仕”的觀念深入人心。經常聽到的是父母對他們(men) 的獨苗說，你隻要專(zhuan) 心讀好書(shu) 就可以了。所以這讀書(shu) 的定義(yi) 就是將教課書(shu) 上的東(dong) 西記住，考試的時候能拿高分……這就是現代科學沒有在中國萌發的根本原因。如果中國文化在這一點上不發生變化，那麽(me) 科學是不能在中國真正紮根的，它隻能蛻化成新的“八股學”。 生命科學是實驗科學，它講究動手。如果實驗科學隻要看看書(shu) 就可以了，那我想問有那位*看看書(shu) 就會(hui) 騎自行車了？或者聽聽體(ti) 育老師的講解就會(hui) 滑冰了？可是光動手不思考，不就成了一個(ge) 工匠？一個(ge) 合格的生命科學研究者，需要在這兩(liang) 方麵完善自己。一個(ge) 傑出的科學工作者，是一個(ge) 熟知科學原理並善於(yu) 應用的“藝術家”。 每個(ge) 曾經用堿法抽提過質粒的同學，希望你看本文後能有所思考，讓中國的未來有希望。   為(wei) 了方便理解，這裏羅列一下堿法質粒抽提用到三種溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們(men) 先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控製好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那麽(me) 50 mM葡萄糖是幹什麽(me) 的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖後zui大的好處隻是懸浮後的大腸杆菌不會(hui) 快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那麽(me) EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jia) 金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑製DNase的活性，和抑製微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸杆菌細胞中的所有二價(jia) 金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什麽(me) 大不了的，隻要不磨洋工，隻要是在不太長的時間裏完成質粒抽提，就不用怕DNA會(hui) 迅速被降解，因為(wei) zui終溶解質粒的TE緩衝(chong) 液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，隻要用等體(ti) 積的水，或LB培養(yang) 基來懸浮菌體(ti) 就可以了。 有一點不能忘的是，菌體(ti) 一定要懸浮均勻，不能有結塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體(ti) 積混合後使用的。要新從(cong) 濃NaOH稀釋製備0.4N的NaOH，無非是為(wei) 了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是* 的溶解細胞的試劑，不管是大腸杆菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會(hui) 幾乎在瞬間就溶解，這是由於(yu) 細胞膜發生了從(cong) bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸杆菌（不妨可以自己試一下），自然就難率抽提得到質粒。如果隻用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為(wei) SDS也是堿性的，隻是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為(wei) 是為(wei) 了讓基因組DNA變性，以便沉澱，這是由於(yu) 沒有正確理解一些書(shu) 上的有關(guan) DNA變性複性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為(wei) 什麽(me) 要加SDS呢？那是為(wei) 下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩(liang) 點：*，時間不能過長，千萬(wan) 不要這時候去接，因為(wei) 在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(hui) 慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(hui) 斷裂。基因組DNA的斷裂會(hui) 帶來麻煩，後麵我再詳細說明。 每個(ge) 人都知道，溶液III加入後就會(hui) 有大量的沉澱，但大部分人卻不明白這沉澱的本質。zui容易產(chan) 生的誤解是，當SDS碰到酸性後發生的沉澱。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這麽(me) 回事了。大量沉澱的出現，顯然與(yu) SDS的加入有關(guan) 係。如果在溶液II中不加SDS會(hui) 怎樣呢，也會(hui) 有少量的沉澱，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉澱出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉澱，那會(hui) 不會(hui) 是遇鹽發生的沉澱呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(hui) 發現SDS在高鹽濃度下是會(hui) 產(chan) 生沉澱的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉澱。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(hui) 發現沉澱的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。如此看來，溶液III加入後的沉澱實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉澱更*。大家知道SDS專(zhuan) 門喜歡和蛋白質結合，平均兩(liang) 個(ge) 氨基酸上結合一個(ge) SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chan) 生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了，讓人高興(xing) 的是大腸杆菌的基因組DNA也一起被共沉澱了。這個(ge) 過程不難想象，因為(wei) 基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉澱了，盡管SDS並不與(yu) DNA分子結合。 那麽(me) 2 M的醋酸又是為(wei) 什麽(me) 而加的呢？是為(wei) 了中和NaOH，因為(wei) 長時間的堿性條件會(hui) 打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發生斷裂，隻要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然zui後得到的質粒上總會(hui) 有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為(wei) 是溶液III加入後基因組DNA無法快速複性就被沉澱了，這是天大的誤會(hui) ，因為(wei) 變性的也好複性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為(wei) 了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個(ge) 副產(chan) 物，與(yu) 它是不是沉澱下來其實沒有關(guan) 係。溶液III加入並混合均勻後在冰上放置，目的是為(wei) 了PDS沉澱更充分一點。 不要以為(wei) PDS沉澱的形成就能將所有的蛋白質沉澱了，其實還有很多蛋白質不能被沉澱，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然後進行酒精沉澱才能得到質量穩定的質粒DNA，不然時間一長就會(hui) 因為(wei) 混入的DNase而發生降解。這裏用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這裏做個(ge) 全麵的介紹。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大於(yu) 氯仿，按道理應該用酚來zui大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心後酚相會(hui) 跑到上層，不利於(yu) 含質粒的水相的回收；但加入氯仿後可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與(yu) 水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提後會(hui) 有大量的酚溶解到水相中，而酚會(hui) 抑製很多酶反應（比如限製性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提後一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉澱時就會(hui) 被除幹淨而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至於(yu) 異戊醇的添加，其作用主要是為(wei) 了讓離心後上下層的界麵更加清晰，也方便了水相的回收。 回收後的水相含有足夠多的鹽，因此隻要加入2倍體(ti) 積的乙醇，在室溫放置幾分鍾後離心就可以將質粒DNA沉澱出來。這時候如果放到－20℃，時間一長反而會(hui) 導致大量鹽的沉澱，這點不同於(yu) 普通的DNA酒精沉澱回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會(hui) 水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發生沉澱。如果感覺發生了鹽的沉澱，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(ge) 小時以上，並用tip將沉澱打碎，就能得到好的樣品。得到的質粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩衝(chong) 液進行溶解，不然大量未降解的RNA會(hui) 幹擾電泳結果的. 瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數情況下你能看到三條帶，但千萬(wan) 不要認為(wei) 你看到的是超螺旋、線性和開環這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質粒後再進行瓊脂糖電泳，就會(hui) 看到線性質粒DNA的位置與(yu) 這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環和複製中間體(ti) （即沒有複製*的兩(liang) 個(ge) 質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入後過度振蕩，會(hui) 有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸杆菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會(hui) 有7－10條帶，這是由於(yu) 特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數不同）所致。這裏暫不深究。  已經提出過許多方法用於(yu) 從(cong) 細菌中提純質粒DNA， 這些方法都含有以下3個(ge) 步驟： 細菌培養(yang) 物的生長。 細菌的收獲和裂解 質粒DNA的純化。 （一）細菌培養(yang) 物的生長 從(cong) 瓊脂平板上挑取一個(ge) 單菌落，接種到培養(yang) 物中（有含有行當抗生素的液體(ti) 培養(yang) 基中生長），然後從(cong) 中純化質粒，質粒的提純幾乎總是如此。現在使用的許多質粒載體(ti) （如pUC係列）都能複製到很高的拷貝數，惟致隻要將培養(yang) 物放在標準LB 培養(yang) 基中生長到對數晚期，就可以大量提純質粒。此時，不必造反性地擴增質粒DNA。然而，較長一代的載體(ti) （如pBR322）由於(yu) 不能如此自由地複製，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yang) 物中加入氯黴素繼續培養(yang) 若幹小時，以便對質粒進行性擴增。氯黴素可抑製宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體(ti) 的複製，然而，鬆弛型質粒仍可繼續複製，在若幹小時內(nei) ，其拷貝數持續遞增。這樣，像pBR322－類的質粒，從(cong) 經氯黴素處理和未經處理的培養(yang) 物中提取質粒的產(chan) 量迥然不同，前者大為(wei) 增高。多年來，加入足以*抑製蛋白質合成的氯黴素μg/ml）已成為(wei) 標準的操作、用該方法提取的質粒DNA量，對於(yu) 分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。 （二）細菌的收獲和裂解 細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去汙劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決(jue) 於(yu) 3個(ge) 因素：質粒的大小、小腸杆菌菌株及裂解後用於(yu) 純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際，但仍可據下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。 1）大質粒（大於(yu) 15kb）容易受損，故應采用漫和裂解法從(cong) 細胞中釋放出來。將細菌懸於(yu) 蔗糖等滲溶液中，然後用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去汙劑溶解球形體(ti) 。這種方法zui大限度地減小了從(cong) 具有正壓的細菌內(nei) 部把質粒釋放出來所需要的作用力。 2）可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA後，有時還在加入溶菌酶後讓細菌暴露於(yu) 去汙劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體(ti) DNA變性，但閉環質粒DNA鏈由於(yu) 處於(yu) 拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢複正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。 3）一些大腸杆菌菌株（如HB101的一些變種衍生株） 用去汙劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨後用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們(men) 會(hui) 惹出麻煩。糖類會(hui) 在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒DNA內(nei) 汙染有糖類，而糖類可抑製多種限製酶的活性。 故從(cong) 諸 如HB101和TG1等大腸杆菌蓖株中大量製備質粒時，不宜使用煮沸法。 4）當從(cong) 表達內(nei) 切核酸酶A的大腸杆菌菌株（endA+株，如HB101） 中小量製備質粒時，建議不使用煮沸法。因為(wei) 煮沸不能*滅活內(nei) 切核酸酶A，以後在溫育（如用限製酶消化）時，質粒DNA會(hui) 被降解。但如果通過一個(ge) 附加步驟（用酚：氯仿進行抽提）可以避免此問題。 5）目前這一代質粒的拷貝數都非常高，以致於(yu) 不需要用氯黴素進行選擇性擴增就可獲得高產(chan) 。然而，某些工作者沿用氯黴素並不是要增加質粒DNA的產(chan) 量，而是要降低細菌細胞在用於(yu) 大量製備的溶液中所占體(ti) 積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為(wei) 費事，而在對數中期在增減物中加入氯黴素可以避免這種現象。有氯黴素存在時從(cong) 較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與(yu) 不加氯黴素時從(cong) 較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。 （三）質粒DNA的純化 常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價(jia) 閉合環狀這樣兩(liang) 個(ge) 性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體(ti) DNA 就取決(jue) 於(yu) 溴化乙錠與(yu) 線狀以及與(yu) 閉環DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與(yu) DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為(wei) 補償(chang) ，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。zui後，超螺旋度大為(wei) 增加， 從(cong) 而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多的染料，直至達到飽和（ 每2個(ge) 堿基對大約結合1個(ge) 溴化乙錠分子） 。由於(yu) 染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為(wei) 製備大量質粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時，為(wei) 此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉澱等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質粒 二、質粒DNA的小量製備 細菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 煮沸裂解 質粒DNA小量製備的問題與(yu) 對策 質粒DNA的小量製備可采用下述的堿裂解法或煮沸法 （一）細菌的收獲和裂解 1．收獲 1）將2ml含相應抗生素的ＬＢ加入到容量為(wei) 15ml 並通氣良好（不蓋緊）的試管中，然後接入一單菌落，於(yu) 30℃劇烈振搖下培養(yang) 過夜。 2）將1.5ml培養(yang) 物倒入微量離心管中，用微量離心機於(yu) 4℃以12000g離心30秒，將剩餘(yu) 的培養(yang) 物貯存於(yu) 4℃。 3）吸去培養(yang) 液，使細菌沉澱盡可能幹燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與(yu) 真空管道相連輕緩抽吸，並用吸頭接觸液麵。當液體(ti) 從(cong) 管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉澱，然後繼續用吸頭通過抽真空除去附於(yu) 管壁的液滴。 2．堿裂解法 1）將細菌沉澱，所得重懸於(yu) 100μl用冰預冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 溶液Ｉ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl（pH8.0） 10mmol/LEDTA（pH8.0） 溶液Ｉ可成批配製，每瓶約100ml,在10lbf/in2（6.895×104Pa） 高壓下蒸氣滅菌15分鍾，貯存於(yu) 4℃。須確使細菌沉澱在溶液Ｉ中*分散，將兩(liang) 個(ge) 微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉澱迅速分散。 2）加200μl新配製的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（臨(lin) 用前用10mol/L貯存液現用現稀釋） 1%SDS 蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內(nei) 容物。應確保離心管的整個(ge) 內(nei) 表麵 均與(yu) 溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置於(yu) 冰上。 3）加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ 溶液Ⅲ 5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。 蓋緊管口，將管倒置後和地振蕩10秒鍾溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之後 將管置於(yu) 冰上3－5分鍾。 4）用微量離心機於(yu) 4℃12 000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。 5）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機於(yu) 4 ℃以12000g離心 2分鍾，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為(wei) 不*酚：氯仿進行抽提，然而由於(yu) 一些未知的原因，省略這一步，往往會(hui) 得到可耐受限製酶切反應的DNA。 6）用2倍休積的乙醇於(yu) 室溫沉澱雙錠DNA。振蕩混合， 於(yu) 室溫放置2分鍾。 7）用微量離心機於(yu) 4℃以12 000g離心5分鍾。 8）小心吸去上清液，將離心管倒置於(yu) 一張紙巾上，以使所有液體(ti) 流出。再將附於(yu) 管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與(yu) 真空管道相連，並用吸頭接觸液麵。當液體(ti) 從(cong) 管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉澱，然後繼續用吸頭通過抽真空除去附於(yu) 管壁的液滴。 9）用1ml70%乙醇於(yu) 4℃洗滌雙鏈DNA沉澱，按步驟8）所術方法去掉上清，在空氣中使核酸沉澱幹燥10分鍾。 i.此法製備的高拷貝數質粒（如Ｘf3或pUC），其產(chan) 量一般約為(wei) ：每毫升原細菌培養(yang) 物3－5μg。 ii．如果要通過限製酶切割反應來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內(nei) ，加1μl 10×限製酶緩衝(chong) 液和1單位所需限製酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩餘(yu) 的DNA貯存於(yu) －20℃。 iii.此方法按適當比例放大可適用於(yu) 100ml細菌培養(yang) 物： 3．煮沸裂解 1）將細菌沉澱，所得重懸於(yu) 350μlSTET中。 STET 0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH8.0） 5% Triton X-100 2）加25μl新配製的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）配製]，振蕩3秒鍾以混勻之。如果溶淮中pH低於(yu) 8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。 3）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為(wei) 40秒。 4）用微量離心機於(yu) 室溫以12 000g離心10分種。 5）用無菌牙簽從(cong) 微量離心管中去除細菌碎片。 6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，於(yu) 室溫放置5分鍾。 7）用微量離心機於(yu) 4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉澱。 8）小心吸去上清液，將離心管倒置於(yu) 一張紙巾上，以使所有液體(ti) 流出。再將附於(yu) 管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與(yu) 真空管道相連，輕緩抽吸，並用吸頭接觸液麵。當液體(ti) 從(cong) 管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉澱，然後繼續用吸頭通過抽真空除去附於(yu) 管的液滴。 9）加1ml 70％乙醇，於(yu) 4℃以12 000g離心2分鍾。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為(wei) 有時沉澱塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放於(yu) 室溫直至乙醇揮發殆盡，管內(nei) 無可見的液體(ti) （2－5）分鍾。 11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振蕩，貯存於(yu) -20℃。 注：當從(cong) 表達內(nei) 切核酸酶Ａ的大腸杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量製粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為(wei) 煮沸步驟不能*滅活內(nei) 切核酸酶Ａ，以後在Mg 2+存在下溫育（V中用限製酶時）質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。 （二）質粒DNA小量製備的問題與(yu) 對策 裂解和煮佛法都極其可靠，重複性也很好，而且一般沒有會(hui) 麽(me) 麻煩。多年來，在我們(men) 實驗室中日常使用這兩(liang) 種方法的過程中，隻碰到過兩(liang) 個(ge) 問題： 1）有些工作者進行小量製備時，有時會(hui) 發現質粒DNA不能被限製酶所切割，這幾乎總是由於(yu) 從(cong) 細菌沉澱或從(cong) 核酸沉澱中去除所有上清液時注意得不夠。大多數情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。 2）在十分偶然的情況下，個(ge) 別小時製備物會(hui) 出現無質粒DNA的現象。這幾乎肯定是由於(yu) 核酸沉澱顆粒已同乙醇一起被棄去。 三、質粒DNA的大量製備 在豐(feng) 富培養(yang) 基中擴增質粒 細菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 （一）在豐(feng) 富培養(yang) 基中擴增質粒 許多年來，一直認為(wei) 在氯黴素存在下擴增質粒隻對生長在基本培養(yang) 基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl複製子的高拷貝數質粒的大腸杆菌菌株中，采用以下步驟可提高產(chan) 量至每500ml培養(yang) 物2－5mg質粒DNA，而且重複性也很好。 1）將30ml含有目的質粒的細菌培養(yang) 物培養(yang) 到對數晚期（DNA 600約0.6）。培養(yang) 基中應含有相應抗生素，用單菌落或從(cong) 單菌落中生長起來的小量液體(ti) 閉關(guan) 物進行接種。 2）將含相應抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yang) 基（預加溫至37℃）施放入25ml對數晚期的培養(yang) 物，於(yu) 37℃劇烈振搖培養(yang) 25小時（搖床轉速300轉/分），所得培養(yang) 物的OD 600值約為(wei) 0.4。 3）可做可不做：加2.5ml氯黴素溶液（34mg/ml溶於(yu) 乙醇），使終濃度為(wei) 170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內(nei) 隻以中等拷貝婁竿行複的質粒，有必要通過擴增。這些質粒隻要從(cong) 生長達到餉新一代的質粒（如pUC質粒）可複製達到很高的拷貝數，因此無需擴增。這些質粒隻要從(cong) 生長達到飽和的細菌培養(yang) 物即可大量提純。但用氯黴素進行處理，具有抑製細菌複製的優(you) 點，可減少細菌裂解物的體(ti) 積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養(yang) 物裏加入氯黴素略顯不便，但用氯黴素處理還是利大於(yu) 弊。 4）於(yu) 37℃劇烈振搖（300轉/分），繼續培養(yang) 12-16小時。 （二）細菌的收獲和裂解 1．收獲 1）用合適轉頭於(yu) 4℃以4000轉/分離心15分鍾，棄上清，敞開離心管口並倒置離心管使上清全部流盡。 2）將細菌沉澱重懸於(yu) 100ml用冰預冷的STE中。 STE 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 1mmol/L EDTA（pH8.0） 2）按步驟1）所述方法離心，以收集細菌細胞。 2，堿裂解法 1）將冼過的500ml 培養(yang) 物的細菌沉澱物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸於(yu) 10ml（18ml）溶液Ｉ中。 溶液Ｉ 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 溶液Ｉ可成批配製，在10 lbf/in2（6.895x104Pa）高壓下蒸氣滅菌15分鍾，貯存於(yu) 4℃。 2）加1ml（2ml）新配製的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶於(yu) 10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）]。當溶液的pH值低於(yu) 8.0時，溶菌酶不能有效工作。 3）加20ml（40ml）新配製的溶液Ⅱ。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（臨(lin) 用前用10mol/L貯存液現用現稀釋） 1％SDS 蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內(nei) 容物。於(yu) 室溫放置5-10分鍾。 4）加15nl（20ml）用冰預冷的溶液Ⅲ。 溶液Ⅲ 5mol/L乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。 封住瓶口，搖動離心瓶數次以混勻內(nei) 容物，此時應不再出現分明的兩(liang) 個(ge) 液相。置冰上放10分鍾，應形成一白色絮狀沉澱。於(yu) 0℃放置後所形成的沉澱應包括染體(ti) DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質－膜複合物。 5）用合適轉頭於(yu) 4℃以4000轉/分離心15分鍾，不開刹車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鍾， 然後盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nei) 的粘稠狀液體(ti) 。未能形成致密沉澱塊的原因通常是由於(yu) 溶液Ⅲ與(yu) 細菌裂解物混合不充分[步驟4）]。 6）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體(ti) 積的異丙醇，充分混勻，於(yu) 室溫放置10分鍾。 7）用合適轉頭於(yu) 室溫以500轉/分離心15分鍾，回收核酸。如於(yu) 4℃離心，鹽也會(hui) 了生沉澱。 8）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘餘(yu) 上清液流盡，於(yu) 室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與(yu) 真空裝置相聯的巴期德吸出附於(yu) 瓶壁的所有液滴，於(yu) 室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui後殘餘(yu) 的痕量乙醇揮殆盡。 9）用3ml TE（pH8.0）溶解核酸沉澱。 四、質粒DNA的純化 聚乙二醇沉澱法質粒DNA 氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環DNA （一）聚乙二醇沉澱法提取質粒DNA 1）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭於(yu) 4℃下以10 000轉/分離心10分鍾。LiCl可沉澱高分子RNA。 2）將上清轉移到另一30mlCorex管內(nei) ，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉頭（或與(yu) 其相當的轉尖）於(yu) 室溫以10 000轉/分離心10分釧， 回收沉澱的核酸。 3）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使zui後殘留的液滴流盡。於(yu) 室溫用70％乙醇洗滌沉澱及管壁，流盡乙醇，用與(yu) 真空裝置相連的巴其德吸管吸去附於(yu) 管壁的所有液滴，敞開管口並將管侄置，在紙巾上放置幾分鍾，以使zui後殘餘(yu) 的痕量乙醇蒸發殆盡。 4）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉澱，將溶液轉到一微量離心管中，於(yu) 室溫放置30分鍾。 5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機於(yu) 4℃以12000g離心5分鍾，以回收質粒DNA。 6）吸出上清，用400μl TE（pH8.0）溶解質粒DNA沉澱。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。 7）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體(ti) 積（約1ml）乙醇，於(yu) 室溫放置10分鍾，於(yu) 4℃以12 000g離心5分鍾，以回收沉澱的質粒DNA。 8）吸去上清，加200μl處於(yu) 4℃以12 000g離心2分鍾。 9）吸去上清，敞開管口，將管置於(yu) 實驗桌上直到zui後可見的痕量乙醇蒸發殆盡。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉澱1:100稀釋[用TE（pH8.0）] 後測量OD 260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml）， 然後將DNA貯於(yu) －20℃。 10）純化。