DEAE-Sephadex A-50柱層析純化免疫球蛋白

（一）　原理 　　DEAE-SephadexA-50（二乙基氨基乙基-葡聚糖A-50）為(wei) 弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉變為(wei) OH-型後，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬於(yu) 中性蛋白（等電點為(wei) PH6.85～7.5），其餘(yu) 均屬酸性蛋白。在PH7.2～7.4的環境中，酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附，隻有γ球蛋白不被吸附。因此，通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從(cong) 而便可分離獲得純化的IgG。DEAE-sephadexA-50柱層析是離子交換層析的一種。 　　（二）試劑和器材 　　1、試劑: 　　（1）鹽析提取的人γ球蛋白； 　　（2）0.5N NaOH，0.5N HCl 2M NaCl，10％NaN3； 　　（3）DEAE-Sephadex A-50，聚乙二醇（PEG）； 　　（4）0.1M, PH7.4 PB（配製見鹽析部分）； 　　2、器材: 　　（1）層析玻璃柱（1.3×40cm），滴定鐵架，自由夾，螺旋夾，尼龍紗（200目）； 　　（2）普通冰箱，751桮型紫外分光光度計，電導儀(yi) 、抽濾裝置（包括抽氣機、幹燥瓶、布氏漏鬥、橡皮墊圈、抽濾瓶），PH計； 　　（3）透析袋、座標紙、濾紙、PH精密試紙； 　　（4）量筒、燒杯、試管、吸管、滴管、滅菌小瓶等。 　　（三） 操作步驟 　　1、DEAE-Sephadex A-50預處理 　　稱DEAE-Sephadex A-50（下稱A-50）5克，懸於(yu) 500ml蒸餾水，1小時後傾(qing) 去上層細粒。按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，將A-50浸泡於(yu) 0.5N NaOH中，攪勻，靜置30分鍾，裝入布氏漏鬥（墊有2層濾紙）中抽濾，並反複用蒸餾水抽洗至PH呈中性；再以0.5N HCl同上操作過程處理，zui後以0.5N NaOH再處理一次。處理完後，將A-50浸泡於(yu) 0.1M，PH 7.4 PB中過夜。 　　2、裝柱 　　（1）將層析柱垂直固定於(yu) 滴定鐵架上，柱底墊一園尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管並關(guan) 閉開關(guan) 。 　　（2）將0.1M，PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入經預處理並以同上緩衝(chong) 液調成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2-3cm厚時，啟開出水口螺旋夾，控製流速1ml/分鍾，同時連續倒入糊狀A-50凝膠至所需高度。 　　（3）關(guan) 閉出水口，待A-50凝膠*沉降後，柱麵放一園形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與(yu) 洗脫液瓶相連接。 　　3、平衡:啟開出水口螺旋夾，控製流速12-14滴/分鍾，使約2倍床體(ti) 積的洗脫液流出。並以PH計與(yu) 電導儀(yi) 分別測定洗脫液及流出液之PH值與(yu) 離子強度是否相同。達到一致時關(guan) 閉出水口，停止平衡。 　　4、加樣及洗脫: 　　啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體(ti) 緩慢滴出，當柱麵液體(ti) 與(yu) 柱麵相切時，立即關(guan) 閉出水口，以毛細滴管沿柱壁加入樣品（體(ti) 積應<床體(ti) 積的2％，蛋白濃度以<100mg為(wei) 宜）。鬆開出水口螺旋夾使柱麵樣品緩慢進入柱內(nei) ，至與(yu) 柱麵相切時，立即關(guan) 閉下口，以少量洗脫液洗柱壁2-3次；再放開出水口，使洗液進入床柱，隨後立即於(yu) 柱麵上加入數ml洗脫液，緊塞柱上口，使整個(ge) 洗脫過程成一密閉係統。並控製流速12～14滴／分鍾。 　　5.　收集：開始洗脫的同時就以試管進行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。 　　6.　測蛋白：以751-G型紫外分光光度計分別測定每管OD280nm，與(yu) OD260nm，按前述公式計算各管蛋白含量。並以OD280nm為(wei) 縱座標，以試管編號為(wei) 橫座標，繪製洗脫曲線。 　　7.　合並、濃縮：將洗脫峰的上坡段與(yu) 下坡段各管收集液分別進行合並，以PEG（MW6000）洗縮至所需體(ti) 積，加入0.02％NaN３防腐劑，於(yu) 4℃保存備用。 　　8.　A-50凝膠的再生:在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然後按預處理過程將A-50再處理一遍即達再生。近期用時泡於(yu) 洗脫緩衝(chong) 液中４℃保存；近期不用時，以*洗2次，再置50℃溫箱烘幹，裝瓶內(nei) 保存。 　　（四）　注意事項 　　1.　柱的選擇：從(cong) 理論上說，隻要柱足夠長，就得獲得理想的分辨率，但由於(yu) 層析柱流速同壓力梯度有關(guan) ，柱長增加使流速減慢，峰變寬，分辨率降低。柱的直徑增加，使液體(ti) 流動的不均勻性增加，分辨率明顯下降。 　　2.　純化過程必須嚴(yan) 格控製脫緩衝(chong) 液的PH及離子強度。樣品與(yu) A-50凝膠必須用洗脫緩衝(chong) 液*平衡後，才能進行柱層析。 　　3.　所裝的柱床必須表麵平整，無溝流及氣泡，否則應重裝。 　　4.　洗脫過程中應嚴(yan) 格控製流速，且勿過快。 　　5.　上樣的體(ti) 積要小，濃度不宜過高。 　　6.　加樣及整個(ge) 洗脫過程中，嚴(yan) 防柱麵變幹。