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更新時間：2013-06-13
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1975年，Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產(chan) 生抗體(ti) ，又可無限增殖，從(cong) 而創立了單克隆抗體(ti) 雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅(jin) 為(wei) 醫學與(yu) 生物學基礎研究開創了新紀元，也為(wei) 臨(lin) 床疾病的診、防、治提供了新的工具。
製備單克隆抗體(ti) 包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體(ti) 、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體(ti) 的大量生產(chan) ，要經過幾個(ge) 月的一係列實驗步驟，下麵按照製備單克隆抗體(ti) 的流程順序，逐一介紹其實驗方法。
細胞融合前準備
細胞融合，選擇雜交瘤
抗體(ti) 的檢測
雜交瘤的克隆化和凍存
單克隆抗體(ti) 的大量生產(chan)
單克隆抗體(ti) 的鑒定
影響因素、失敗原因分析
（一） 免疫方案
選擇合適的免疫方案對於(yu) 細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關(guan) 重要。一般要在融合前兩(liang) 個(ge) 月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
1. 顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下麵以細胞性抗原為(wei) 例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip （腹腔內(nei) 注射）
↓ 2～3周後
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周後
加強免疫（融合前三天） 1×10７／0.5ml ip或iv（靜脈內(nei) 注射）
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑。要求抗原和佐劑等體(ti) 積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水麵上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖，使沉澱的分枝杆菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點注射
│ （一般0.8～1ml 0.2ml／點）
↓3周後
第二次免疫 劑量同上，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ （ip劑量不宜超過0.5ml）
↓3周後
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip
│ （5～7天後采血測其效價(jia) ，檢測免疫效果）
↓2～3周後
加強免疫，劑量50～500μg為(wei) 宜，ip或iv
↓3天後
取脾融合
目前，用於(yu) 可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方麵增強了抗原的免疫原性，另一方麵可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接采用脾內(nei) 注射。③使用細胞因子作為(wei) 佐劑，提高機體(ti) 的免疫應答水平，促進免疫細胞對抗原反應性。
（二） 飼養(yang) 細胞
在製備單克隆抗體(ti) 過程中，許多環節需要加飼養(yang) 細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yang) 過程中，加入飼養(yang) 細胞是十分必要的。常用的飼養(yang) 細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為(wei) 常用）、小鼠脾髒細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞係3T3經放射線照射後作為(wei) 飼養(yang) 細胞，使用比較方便，照射後可放入液氮罐長期保存，隨用隨複蘇。
小鼠腹腔巨噬細胞的製備
小鼠采用與(yu) 免疫小鼠相同的品係，常用BaLb／c小鼠6～10周齡
↓
拉頸處死 浸泡於(yu) 75％酒精，消毒3～5分鍾
↓
用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜
↓
用無菌注射器注入6～8ml培養(yang) 液
↓
反複衝(chong) 洗，吸出衝(chong) 洗液
↓
放入10ml離心管，1200轉／分離心5～6分鍾
↓
用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yang) 液混懸，調整細胞數1×10５／ml
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培養(yang)
一般飼養(yang) 細胞在融合前一天製備，一隻小鼠可獲得5～8×106腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為(wei) 飼養(yang) 細胞時，細胞濃度為(wei) 5×106／ml，小鼠脾細胞為(wei) 1×106／ml，小鼠的成纖維細胞（3T3）1×105／ml，均為(wei) 100μl／孔。
（三） 骨髓瘤細胞
骨髓瘤細胞係應和免疫動物屬於(yu) 同一品係，這樣雜交融合率高，也便於(yu) 接種雜交瘤細胞在同一品係小鼠腹腔內(nei) 產(chan) 生大量 McAb。
常用骨髓瘤細胞係有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤細胞的培養(yang) 適合於(yu) 一般的培養(yang) 液，如RPMI1640，DMEM培養(yang) 基。小牛血清的濃度一般在10～20％，細胞的zui大密度不得超10６／ml，一般擴大培養(yang) 以1∶10稀釋傳(chuan) 代，每3～5天傳(chuan) 代一次。細胞的倍增時間為(wei) 16～20小時，上述三株骨髓瘤細胞係均為(wei) 懸浮或輕微貼壁生長，隻用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。
一般在準備融合前的兩(liang) 周就應開始複蘇骨髓瘤細胞，為(wei) 確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG（8氮雜鳥嘌呤）篩選一次，以防止細胞的突變。
保證骨髓瘤細胞處於(yu) 對數生長期，良好的形態，活細胞計數高於(yu) 95％，也是決(jue) 定細胞融合的關(guan) 鍵。
（四） 免疫脾細胞
免疫脾細胞指的是處於(yu) 免疫狀態脾髒中B淋巴母細胞棗漿母細胞。一般取zui後一次加強免疫3天以後的脾髒，製備成細胞懸液，由於(yu) 此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細胞懸液的製備：在無菌條件下取出脾髒，用不*的培養(yang) 液洗一次，置平皿中不鏽鋼篩網上，用注射器針芯研磨成細胞懸液後計數。一般免疫後脾髒體(ti) 積約是正常鼠脾髒體(ti) 積的２倍，細胞數為(wei) ２×10８左右。
（一） 細胞融合流程
（1） 取對數生長的骨髓瘤細胞SP2／0，1000rpm離心5分鍾，棄上清，用不*培養(yang) 液混懸細胞後計數，取所需的細胞數，用不*培養(yang) 液洗滌2次。
（2） 同時製備免疫脾細胞懸液，用不*培養(yang) 液洗滌2次。
（3） 將骨髓瘤細胞與(yu) 脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nei) 用不*培養(yang) 液洗1次，1200rpm,8分鍾。
（4） 棄上清，用滴管吸淨殘留液體(ti) ，以免影響PEG的濃度。
（5） 輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略加鬆動。
（6） 在室溫下融合:
① 30秒內(nei) 加入預熱的1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，邊加邊攪拌。
② 作用90秒鍾，若冬天室溫較低時可延長至120秒鍾。
③ 加預熱的不*培養(yang) 液，終止PEG作用，每隔２分鍾分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
（7） 離心，800rpm，6分鍾。
（8） 棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。
（9） 根據所用96孔培養(yang) 板的數量，補加*培養(yang) 液，10ml一塊96孔板。
（10） 將融合後細胞懸液加入含有飼養(yang) 細胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培養(yang) 。
一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。
（二） HAT選擇雜交瘤
應用HAT 選擇培養(yang) 液篩選雜交瘤細胞的原理已在研究生專(zhuan) 題講座第六專(zhuan) 題中已經提到，這裏主要介紹加HAT選擇培養(yang) 的時間和濃度。
一般在融合24小時後，加HAT選擇培養(yang) 液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1ml加入50ml20％小牛血清*培養(yang) 液中。
因為(wei) 在培養(yang) 板內(nei) 已加入飼養(yang) 細胞、融合後的細胞，200μl／孔。所以在加選擇培養(yang) 液時應加3倍量的HAT。我們(men) 認為(wei) ，融合後zui初補加的量可用全量的2／3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。
50×HAT
H: 5×10-3M
A: 2×10-5M
T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養(yang) 液維持培養(yang) 兩(liang) 周後，改用HT培養(yang) 液，再維持培養(yang) 兩(liang) 周，改用一般培養(yang) 液。
篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養(yang) 而獲得雜交細胞係中，僅(jin) 少數能分泌針對免疫原的特異性抗體(ti) 。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1／10麵積時，即可開始檢測特異性抗體(ti) ，篩選出所需要的雜交瘤細胞係。
檢測抗體(ti) 的方法應根據抗原的性質、抗體(ti) 的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為(wei) 原則。
常用的方法有:
1. ELISA用於(yu) 可溶性抗原（蛋白質）、細胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用於(yu) 可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
3. FACS（熒光激活細胞分類儀(yi) ）用於(yu) 檢查細胞表麵抗原的McAb檢測。
4. IFA用於(yu) 細胞和病毒McAb的檢測。
上述方法均為(wei) 一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體(ti) 的實驗過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由於(yu) 方法不當貽誤整個(ge) 篩選時機。
克隆化一般是指將抗體(ti) 陽性孔進行克隆化。犚r為(wei) 經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個(ge) 孔內(nei) 隻有一個(ge) 克隆。在實際工作中，可能會(hui) 有數個(ge) 甚至更多的克隆，可能包括抗體(ti) 分泌細胞、抗體(ti) 非分泌細胞；所需要的抗體(ti) （特異性抗體(ti) ）分泌細胞和其它無關(guan) 抗體(ti) 分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對於(yu) 檢測抗體(ti) 陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體(ti) 分泌的細胞會(hui) 被抗體(ti) 非分泌的細胞所抑製，因為(wei) 抗體(ti) 非分泌細胞的生長速度比抗體(ti) 分泌的細胞生長速度快，二者競爭(zheng) 的結果會(hui) 使抗體(ti) 分泌的細胞丟(diu) 失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體(ti) 丟(diu) 失，從(cong) 而喪(sang) 失產(chan) 生抗體(ti) 的能力。
（一） 克隆化方案
用克隆化的方法很多，而zui常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
1. 有限稀釋法的程序
① 製備飼養(yang) 細胞懸液（同融合前準備）
② 陽性孔細胞的計數，並調細胞數在1～5×10３／ml
③ 取130個(ge) 細胞放入6.5ml含飼養(yang) 細胞*培養(yang) 液，即20個(ge) 細胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排為(wei) 每孔2個(ge) 細胞。餘(yu) 下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yang) 細胞的*培養(yang) 液,細胞數為(wei) 10個(ge) ／ml，100μl／孔加D、E、F三排，為(wei) 每孔1個(ge) 細胞。餘(yu) 下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yang) 細胞的*培養(yang) 液，細胞數5個(ge) ／ml，100μl／孔，加G、H兩(liang) 排，為(wei) 每孔0.5個(ge) 細胞。
④ 培養(yang) 4～5天後，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加*培養(yang) 液200μl／孔。
⑤ 第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體(ti) 檢測。
注:初次克隆化的雜交瘤細胞需要在*培養(yang) 液中加HT。
2. 軟瓊脂法
① 軟瓊脂的配製
含20％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640
1％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。
0.5％瓊脂：由1份1％瓊脂加1份含20％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。
② 用上述0.5％瓊脂液（含有飼養(yang) 細胞）15ml傾(qing) 注於(yu) 直徑為(wei) 9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為(wei) 基底層備用。
③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。
④ 1ml 0.5％瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與(yu) 1ml不同濃度的細胞懸液相混合。
⑤ 混勻後立即傾(qing) 注於(yu) 瓊脂基底層上，在室溫中10分鍾，使其凝固，孵育於(yu) 37℃，5％CO2孵箱中。
⑥ 4～5天後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養(yang) 細胞的24孔板中進行培養(yang) 。
⑦ 檢測抗體(ti) ，擴大培養(yang) ，必要時再克隆化。
（二） 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞(ya) 克隆細胞是十分重要的。因為(wei) 在沒有建立一個(ge) 穩定分泌抗體(ti) 的細胞係的時候，細胞的培養(yang) 過程中隨時可能發生細胞的汙染、分泌抗體(ti) 能力的喪(sang) 失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為(wei) 上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞係的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yang) 環境不同而改變，在24孔培養(yang) 板中培養(yang) ，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細胞凍存液:
50％小牛血清
40％不*培養(yang) 液
10％ DMSO（二甲亞(ya) 碸）
凍存液預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從(cong) 室溫可立即降到0℃，再降溫時一般按每分鍾降溫2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或細胞管降至0℃ 後放-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期複蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體(ti) 的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
大量生產(chan) 單克隆抗體(ti) 的方法主要有兩(liang) 種：
1. 體(ti) 外使用旋轉培養(yang) 管大量培養(yang) 雜交瘤細胞，從(cong) 上清中獲取單克隆抗體(ti) 。但此方法產(chan) 量低，一般培養(yang) 液含量為(wei) 10～60μg／ml，如果大量生產(chan) ，費用較高。
2. 體(ti) 內(nei) 接種雜交瘤細胞，製備腹水或血清。
① 實體(ti) 瘤法 對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107／ml接種於(yu) 小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從(cong) 血清中獲得單克隆抗體(ti) 含量可達到1-10mg／ml。但采血量有限。
② 腹水的製備 常規是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液體(ti) 石臘於(yu) BaLb／c鼠，1～2周後腹腔注射1×106個(ge) 雜交瘤細胞，接種細胞7～10天後可產(chan) 生腹水，密切觀察動物的健康狀況與(yu) 腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻於(yu) 死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一隻小鼠可獲1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反複收集數次。腹水中單克隆抗體(ti) 含量可達5-20mg/ml， 這是目前zui常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，複蘇後轉種小鼠腹腔則產(chan) 生腹水快、量多。
對製備的McAb進行係統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方麵的鑒定:
1. 抗體(ti) 特異性的鑒定：除用免疫原（抗原）進行抗體(ti) 的檢測外，還應用與(yu) 其抗原成分相關(guan) 的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如①製備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應用其它髒器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guan) 抗原的單克隆抗體(ti) 。② 製備抗重組的細胞因子的單克隆抗體(ti) ，應首先考慮是否與(yu) 表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與(yu) 其它細胞因子間有無交叉。
2. McAb的Ig類與(yu) 亞(ya) 類的鑒定：一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體(ti) 進行篩選時，已經基本上確定了抗體(ti) 的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體(ti) 一般是IgG類或IgM類。至於(yu) 亞(ya) 類則需要用標準抗亞(ya) 類血清係統作雙擴或夾心ELISA來確定McAb的亞(ya) 類。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3％），將有利於(yu) 沉澱線的形成。
3. McAb中和活性的鑒定：用動物的或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體(ti) 和病毒同時接種於(yu) 易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體(ti) 的保護。
4. McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭(zheng) 結合試驗、測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。
5. McAb親(qin) 和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭(zheng) 結合試驗來確定McAb與(yu) 相應抗原結合的親(qin) 和力。
由於(yu) 製備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(hui) 造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有:
1. 汙染：包括細菌、黴菌和支原體(ti) 的汙染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問題。一旦發現有黴菌汙染就應及早將汙染板棄之，以免汙染整個(ge) 培養(yang) 環境。支原體(ti) 的汙染主要來源於(yu) 牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環境也可能造成支原體(ti) 汙染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳(chuan) 代培養(yang) 的細胞係進行支原體(ti) 的檢查，查出汙染源應及時采取措施處理。對於(yu) 汙染的雜交瘤細胞可以采取生物學的過濾方法，將汙染的雜交瘤細胞注射於(yu) BALB／c小鼠的腹腔，待長出腹水或實體(ti) 瘤時，犖^菌取出分離雜交瘤細胞，一般可除去支原體(ti) 汙染。
2. 融合後雜交瘤不生長：在保證融合技術沒有問題的前提下主要考慮下列因素①PEG有毒性或作用時間過長。②牛血清的質量太差，用前沒有進行嚴(yan) 格的篩選。③骨髓瘤細胞汙染了支原體(ti) 。④HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足。
3. 雜交瘤細胞不分泌抗體(ti) 或停止分泌抗體(ti)
① 融合後有細胞生長，但無抗體(ti) 產(chan) 生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細胞發生突變，變成A抵抗細胞所致。
② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。
③ 對於(yu) 原分泌抗體(ti) 的雜交瘤細胞變為(wei) 陰性，可能是細胞支原體(ti) 汙染，或非抗體(ti) 分泌細胞克隆競爭(zheng) 性生長，從(cong) 而抑製了抗體(ti) 分泌細胞的生長。也可能發生染色體(ti) 丟(diu) 失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體(ti) 停止分泌的有效措施。
三要:
要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。
要應用倒置顯微鏡經常檢查細胞的生長狀況。
要定期進行再克隆。
三不要:
不要讓細胞“過度生長”。因為(wei) 非分泌的雜交瘤細胞將成為(wei) 優(you) 勢，壓倒分泌抗體(ti) 的雜交瘤細胞。
不要讓培養(yang) 物不加檢查地任其連續培養(yang) 幾周或幾個(ge) 月。
不要不經克隆化而使雜交瘤在機體(ti) 內(nei) 以腫瘤生長形式連續傳(chuan) 好幾代。
4. 雜交瘤細胞難以克隆化
可能與(yu) 小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關(guan) ，或由於(yu) 細胞有支原體(ti) 汙染，使克隆化難以成功。若是融合後的早期克隆化，應在培養(yang) 液加HT。
當前位置：
