免疫血清的製備

撰稿　李恩善 免疫血清的製備是一項常用的免疫學實驗技術。價(jia) 、高特異性的免疫血清可作為(wei) 免疫學診斷的試劑（如用於(yu) 製備免疫標記抗體(ti) 等），也可供特異性免疫治療用。免疫血清的效價(jia) 高低取決(jue) 於(yu) 實驗動物的免疫反應性及抗原的免疫原性。如以免疫原性強的抗原刺激高應答性的機體(ti) ，常可獲得價(jia) 的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫時，則需同時加用佐劑以增強抗原的免疫原性。免疫血清的特異性主要取決(jue) 於(yu) 免疫用抗原的純度。因此，如欲獲得高特異性的免疫血清，必須予先純化抗原。此外，抗原的劑量、免疫途徑及注射抗原的時間間隔等，也是影響免疫血清效價(jia) 的重要因素應予重視。 　　一、原理 　　具有免疫原性的抗原可刺激機體(ti) 相應B細胞增殖、分化形成漿細胞並分泌特異性抗體(ti) 。由於(yu) 抗原分子表麵的不同決(jue) 定簇為(wei) 不同特異性的B細胞克隆所識別，因此由某一抗原刺激機體(ti) 後產(chan) 生的抗體(ti) ，實際上為(wei) 針對該抗原分子表麵不同決(jue) 定簇的抗體(ti) 混合物（即多克隆抗體(ti) ）。另外，抗體(ti) 的產(chan) 生具有回憶應答的規律性，牨m現為(wei) 初次免疫注射與(yu) 再次免疫注射後的抗體(ti) 應答特點截然不同。這是由於(yu) 記憶性B細胞參與(yu) 再次應答所致。 　　二、免疫方法 　　根據抗原的性質不同而異。下麵以製備家兔抗人IgG免疫血清為(wei) 例作具體(ti) 說明。 　　1.　用剪刀剪去家兔兩(liang) 後腳掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮膚； 　　2.　*次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏*佐劑（FCA）乳化的抗原（人IgG）下稱FCA-IgG）液1ml，每側(ce) 腳掌皮下各注入0.5ml。 　　3.　第二次免疫：間隔10-14天後，於(yu) 兩(liang) 側(ce) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結內(nei) 注入FCA-IgG，每個(ge) 淋巴結注0.1ml，其餘(yu) 注入淋巴結附近皮下共1ml。如淋巴結未腫大或腫大不明顯時，直接注入兩(liang) 側(ce) 　窩及鼠蹊部皮下。 　　4.　間隔7-10天後，從(cong) 耳靜脈采血0.5～1.0ml，分離血清，以雙相瓊脂擴散試驗測定免疫血清的抗體(ti) 效價(jia) （即試血）。效價(jia) 至少應達到1∶16以上時才能放血。 　　5.　若效價(jia) 未達到要求，可用不加佐劑的抗原液（人IgG）耳靜脈內(nei) 注射免疫。即於(yu) 1周內(nei) 注射3次，分別為(wei) 0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jia) 達到要求應立即放血。另外,也可在第2次免疫後，以弗氏不*佐劑（FIA）乳化的抗原（人IgG）（簡稱FIA-IgG）再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次，再試血測抗體(ti) 效價(jia) ，如效價(jia) 達到要求立即放血。 　　三、放血 　　（一）　心髒采用血法 　　1.　家兔仰麵，四肢縛於(yu) 動物固定架上（或由助手抓住四肢固定）； 　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮膚； 　　3.　用左姆指摸到胸骨劍突處，食指及中指放在右胸處輕輕向左推心髒，並使心髒固定於(yu) 左胸側(ce) 位置。然後，以左拇指觸摸心髒搏動zui強的部位； 　　4.　用50ml注射器（連接16號針頭），傾(qing) 針45°角度，對準心搏zui強處刺入心髒抽血致死； 　　5.　將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中，待凝固後分離血清。 　　（二）　頸動脈放血法 　　1.　家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚； 　　2.　沿頸部中線切開皮膚約10cm，分離皮下組織，直至暴露出氣管兩(liang) 側(ce) 的胸鎖乳突肌； 　　3.　分離胸鎖乳突肌與(yu) 氣管間的頸三角區疏鬆組織，暴露出頸總動脈後使之遊離； 　　4.　於(yu) 動脈下套入兩(liang) 根黑絲(si) 線，分別置於(yu) 遠心及近心端。結紮遠心端的絲(si) 線。近心端的動脈用血管夾夾住； 　　5.　用尖頭小剪刀在兩(liang) 根絲(si) 線間的動脈璧上剪一小口，插入塑料放血管。再將近心端的絲(si) 線結紮固定於(yu) 放血管上，以防放血管滑脫； 　　6.　鬆開血管夾，使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一隻家兔可放血80～100ml。 　　四、分離血清 　　將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時，再置4℃冰箱內(nei) 3～4小時。待血液凝固血塊收縮後，用毛細滴管吸取血清。於(yu) 3000rpm離心15分鍾，取上清加入防腐劑（0.01％硫柳汞或0.02％疊氮鈉，zui終濃度），分裝後置4℃冰箱中保存備用。 　　五、結果鑒定 　　以雙相瓊脂擴散試驗測定所獲免疫血清的抗體(ti) 效價(jia) ，並用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體(ti) 的質量，應產(chan) 生單一的沉澱弧線。鑒定方法的具體(ti) 步驟參見有關(guan) 部分。 　　六、材料 　　（一）　動物：健康成年家兔，雄性，體(ti) 重2～3公斤。 　　（二）　器材：剪刀、鑷子、注射器（2ml、50ml）附針頭（9號、6號）、稱量瓶（10ml）、量筒、動物固定架、滅菌三角燒瓶（200ml）、手術器械一套、血管夾、黑絲(si) 線、塑料放血管等。 　　（三）　試劑 　　1.　滅菌生理鹽水； 　　2.　純化人IgG（10mg／ml）； 　　3.　消毒酒精及碘酒； 　　4.　羊毛脂； 　　5.　石蠟油； 　　6.　活卡價(jia) 苗（BCG）（75mg／ml）； 　　7.　弗氏不*佐劑（FIA）製備：稱羊毛脂10克，逐滴加入石蠟油40ml，邊滴邊研磨，分裝於(yu) 疫苗瓶中（每瓶10ml），高壓滅菌（8磅20分鍾）後保存備用。 　　8.　弗氏*佐劑乳化抗原（FCA-IgG）的製備：將FIA予溫（60℃30分鍾），吸取3ml於(yu) 研缽中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及純化人IgG2.5ml（2.4mg／ml）牨_滴入邊研磨直至形成均一性的乳狀液，取1滴滴於(yu) 冷水麵上不散開為(wei) 合格。 　　七、注意事項 　　1.　免疫用實驗動物的抗體(ti) 反應性個(ge) 體(ti) 差異性較大，因此免疫時至少應選用兩(liang) 隻以上動物。另外，不能使用妊娠動物。 　　2.　免疫用的抗原必須經FCA或FIA充分乳化後才能注射，否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述製備乳化抗原的方法較費時、費力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法製備。前者是將抗原液與(yu) 佐劑按比例混合後，置於(yu) 混合器上使之劇烈振蕩（頻率2900轉／分，振幅6mm）；後者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合後，吸入注射器內(nei) 再將注射器連接於(yu) 三腔管上反複抽吸研磨。這兩(liang) 種方法約1小時即可使抗原充分乳化。 　　3.　佐劑一方麵可提高特異性免疫反應的效果獲得價(jia) 的免疫血清，但若抗原不純時，可使抗原中極微量的汙染物（0.005mgN）產(chan) 生抗體(ti) ，以致導致免疫血清的純度受到影響。另外，有些實驗動物種係對BCG過敏，尤其是豚鼠其次是家兔，當再次注射*佐劑時,可以引起變態反應而導致免疫失敗。為(wei) 此，第二次免疫注射時應減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑，以減少和防止變態反應的發生。 　　4.　抗原的劑量決(jue) 定於(yu) 抗原的種類。對免疫原性強的抗原劑量應相別較少，免疫原性弱的抗原劑量可相對較多。抗原的用量一般以體(ti) 重計算。在使用佐劑的情況下，一次注入的總劑量以0.5mg／kg體(ti) 重為(wei) 宜。如不加佐劑時劑量可加大10倍。另外，免疫周期長者可少量多次注射，免疫周期短者可較大量少次注射。 　　5.　免疫方法上也可采用多點注射法免疫動物。即於(yu) 家兔脊柱兩(liang) 旁選4-6點皮下注射，同時於(yu) 兩(liang) 側(ce) 肩部（或臂部）和鼠蹊部各注一處。每點注0.2ml，間隔2周後再於(yu) 上述部位選不同點同上注射，也可產(chan) 生價(jia) 的免疫血清。