流式細胞術檢測血小板功能及其臨床應用?

血小板功能的檢測包括測定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相關(guan) 疾病的診斷中，檢測血小板功能的方法常常是有爭(zheng) 議的。這通常是由於(yu) 方法本身的原因造成的［1］，譬如，靜脈阻滯、抗凝劑選擇、離心，甚至標本處理不當等因素，都可導致醫源性血小板激活，影響臨(lin) 床診斷的價(jia) 值。這就要求建立一種靈敏、、快速、簡便，可用於(yu) 臨(lin) 床常規檢測血小板功能測定方法。
 　　由於(yu) 血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷，近年來，文獻報道利用流式細胞術，特別是全血法流式細胞術，檢測血小板膜糖蛋白的表達［2］。該技術能靈敏、特異地檢測血液中活化血小板，並評價(jia) 其功能。現就全血法流式細胞術檢測血小板功能的方法及臨(lin) 床應用現狀和潛力進行綜述。
　　一、全血法流式細胞術
　　1.方法學：流式細胞儀(yi) 能快速測定大量個(ge) 體(ti) 細胞的特性。樣品中欲分析的細胞預先進行熒光標記，然後由壓縮氮經矽管送達標本室，再以5 000～10 000個(ge) 細胞/秒的速率逐個(ge) 射入光敏感區。在適當波長的激發光作用下，被特殊染色的細胞發射出一定量的熒光脈衝(chong) 訊號。探測器收集每個(ge) 細胞的熒光訊號和光散射，然後傳(chuan) 入計算機進行分析。
　　傳(chuan) 統的流式細胞術檢測血小板膜糖蛋白的表達，常用的樣本是經洗滌的血小板或富含血小板的血漿。由於(yu) 血小板極易活化激惹，樣本經離心、洗滌等步驟，容易人為(wei) 地導致體(ti) 外血小板激活，影響臨(lin) 床診斷價(jia) 值。為(wei) 此，Shatti等［2］引入了全血法流式細胞術。該技術能使用全血樣本測定循環中血小板的活化狀態以及血小板對激活劑的功能應答。
　　全血流式細胞術樣本製備步驟為(wei) ：
　　抽血抗凝→稀釋→生物素化的檢測用單克隆抗體(ti) （單抗）→激動劑或緩衝(chong) 液→固定（1%多聚甲醛）→FITC標記的鑒別用單抗→PE-卵白素→稀釋。
　　稀釋樣本是為(wei) 了防止血小板聚集，否則單個(ge) 血小板上的抗原量就測不出來了，因為(wei) 流式細胞儀(yi) 測定的是單個(ge) 粒子的熒光，而不管這單個(ge) 粒子是一個(ge) 血小板還是幾個(ge) 血小板的聚集體(ti) 。當用凝血酶作外源激動劑時，為(wei) 防止血小板聚集並形成纖維蛋白凝塊，可在全血標本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro （GPRP）［3］。固定這一步若不幹擾單抗的結合，生物素化的檢測用單抗也可以在固定後加入。血小板鑒別用單抗可在針對血小板特異性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa的單抗中任選一種。標記這單抗的熒光試劑可在FITC、PE、PE-CY53種熒光染料中任選。
　　樣本隨後用流式細胞儀(yi) 檢測。通過熒光極性和特異性光散射鑒別出血小板後，檢測5 000～10 000個(ge) 血小板表麵的特異性熒光訊號。檢測結果可用兩(liang) 種方法表示。一種是平均顆粒熒光強度，另一種是特異性熒光抗體(ti) 結合陽性血小板的百分率。陽性血小板百分率法與(yu) 熒光信號的放大倍數無關(guan) ，且可以檢測受損傷(shang) 部位血小板亞(ya) 群的變化。如果檢測的是血小板表麵某抗原的總量，則熒光強度法更為(wei) 適合。譬如，在活化狀態下，血小板表麵GPIb-IX-V複合物含量比靜息時低，但降低的幅度小，通常還不足以報告陰性結果［4］，這時用熒光強度法就比陽性血小板百分率法更合適。
　　目前傳(chuan) 統的流式細胞術還不能定量分析結合位點的數目，但Shatti等［2］利用125I和生物素雙標記的單抗進行研究，以PE-卵白素作為(wei) 熒光結合試劑，發現碘標測定的結合位點數與(yu) 熒光強度間有線性關(guan) 係。因此，對於(yu) 一個(ge) 特定的單抗，一旦弄清這一線性關(guan) 係，並知道熒光單抗上熒光素與(yu) 抗體(ti) 的摩爾比，就能利用流式細胞儀(yi) 定量分析該抗體(ti) 結合位點的數目。目前有一些商品試劑盒能定量測定結合到單個(ge) 細胞上的抗體(ti) 數目，但乏見用於(yu) 血小板的報道。
　　2.優(you) 缺點：與(yu) 常規血小板功能測定法比，全血法流式細胞術有許多優(you) 點。
　　首先，標本處理的簡化能避免血小板體(ti) 外醫源性激活，並防止血小板亞(ya) 群丟(diu) 失；循環中的紅細胞、白細胞對血小板的活化有影響，因此本法能在zui接近受檢者體(ti) 內(nei) 環境的條件下測定血小板功能。同時，由於(yu) 使用了血小板鑒別用單抗，檢測的僅(jin) 是血小板，而不會(hui) 受其它種類細胞或碎片的幹擾，保證了檢測的特異性。其次，在血栓性疾病中，通常隻有小部分的血小板被活化；凝血酶體(ti) 外活化血小板，也常表現為(wei) 亞(ya) 群激活；活化血小板表達CD62等膜糖蛋白也有明顯的異質性［5］。本法能靈敏地檢測出少到1%的活化血小板亞(ya) 群［6］，尤其是能分析單個(ge) 或亞(ya) 群血小板膜上活化標誌物的變化，使檢測結果更接近真實。若同時使用FITC、PE、PE-CY5 3種熒光染料，本法通過三色標誌一次能同時檢測兩(liang) 個(ge) 抗原標誌物的變化。
　　此外，做一次檢測僅(jin) 需2 μl血液，這一點，尤其適合於(yu) 新生兒(er) 和血小板減少性疾病患者。本法不使用同位素，沒有放射性汙染。　　全血法流式細胞術也存在不足之處。譬如，流式細胞儀(yi) 價(jia) 格高昂，檢測費用高，儀(yi) 器操作複雜。為(wei) 了避免體(ti) 外活化，血樣需在45分鍾內(nei) 處理，不能久置。另外，流式細胞儀(yi) 僅(jin) 檢測循環中的血小板功能，而β-TG、PF4和TXA2的檢測還能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。雖然存在著這些不足，但本法仍是血小板功能檢測的突破性進展。
　　二、全血中活化血小板的檢測
　　1.血小板特異性膜糖蛋白：本法檢測血小板功能，首先要對全血中的血小板進行特異性熒光標記，將血小板與(yu) 血樣中其他血細胞區分開來。針對血小板表麵特異性膜糖蛋白製備的單抗，使血小板特異性標記成為(wei) 可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究［7］，表1顯示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在這些膜糖蛋白中，僅(jin) 在血小板膜表麵表達主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的幾種［8］。根據這些特異性糖蛋白製備的熒光單抗，能在全血中特異性地識別血小板，僅(jin) 給血小板做上熒光標記。
表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

膜糖蛋白	基因家族	配基	功能
GPⅠa/Ⅱa	整合素（B1）	膠原	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Fn	粘附
GPⅠc/Ⅱa	整合素（B1）	Laminin	粘附
GPⅡb/Ⅲa	整合素（B3）	Fb,vWF,Vn,Fn	聚集
Vn受體(ti)	整合素（B3）	Vn,?vWF,?Fn	粘附
GPⅠb/Ⅸ	LRG	vWF，凝血酶	粘附
GPV	LRG	?	凝血酶底物
GPIV		Thrombospodin	粘附
GP53			血小板-粒細胞
GMP140	選擇素		相互作用

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纖維蛋白原；Fn纖維粘連蛋白；Vn體(ti) 外粘連蛋；LRG富含亮氨酸家族 　　2.活化血小板的標誌物：活化血小板與(yu) 靜息血小板相比，其質膜糖蛋白常發生顯著的變化，這些變化的糖蛋白便成為(wei) 活化血小板的檢測標誌物。　　全血法流式細胞術也是一種免疫學方法，活化血小板表麵能通過免疫方法檢測的標誌物可分為(wei) 三類［9］：*類是血小板顆粒膜上的糖蛋白。血小板被激活時，其顆粒膜與(yu) 質膜發生融合，顆粒膜蛋白，如CD62、CD63，在質膜上表達，成為(wei) 活化血小板的分子標誌。第二類是血小板質膜表麵變化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa（CD41/61）的PAC1表位［10］，它僅(jin) 在血小板活化時才因構象變化而顯露出來。因此，使用這個(ge) 表位的熒光單抗，我們(men) 能更地在更早階段檢測到血小板的活化。另外，GPIV （CD36）雖然在靜息血小板上也表達，但活化血小板上表達量更高［9］；GPIb-IX-V複合物（CD42）則相反，與(yu) 靜息血小板相比，活化血小板上表達量顯著降低［7］。它們(men) 都是活化血小板的分子標誌。第三類是出現在活化血小板上能與(yu) 血小板表麵受體(ti) 相結合的一些抗原，包括纖維蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。這些抗原在血小板表麵的出現和消失在臨(lin) 床檢測上也是有意義(yi) 的。　　除檢測免疫性的分子標誌物外，流式細胞術還能檢測一些反映活化血小板功能的非免疫性指標。如用Ca2+濃度敏感的熒光染料檢測胞內(nei) Ca2+流［10］，用能進入血小板致密顆粒的熒光染料阿的平來檢測活化血小板的釋放功能［11］等。　　3.單抗的選擇：與(yu) 血小板有關(guan) 的CD單抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等。活化血小板的檢測需選擇針對活化血小板標誌物的CD單抗。表2列舉(ju) 了活化血小板檢測的一些代表性單抗。