Vacara 軟骨寡聚基質蛋白（COMP）誘導C57BL/6的小鼠關節炎造模方案

Vacara是一家瑞典公司，致力於(yu) 開發新型類風濕性關(guan) 節炎診斷試劑盒、創新的預防和治療方法。產(chan) 品包括：診斷試劑盒、疫苗研究產(chan) 品、保護性抗體(ti) 以及人源化動物模型和用於(yu) 誘導設計的免疫反應和誘導T細胞介導的關(guan) 節炎的抗原（Cag1、Cag2、Cag3、Cag4、Cag5）。

背景簡介：

轉基因小鼠研究常用的品係是C57BL/6遺傳(chuan) 背景小鼠，由於(yu) 缺乏該品係的類風濕關(guan) 節炎（RA）可靠模型而限製了該品係在風濕病研究中的的應用。膠原誘導的關(guan) 節炎（CIA）是廣泛的類風濕關(guan) 節炎動物模型，而C57BL/6小鼠由於(yu) 具有MHC II類單倍型H-2b，其不能有效用於(yu) 製備膠原誘導的關(guan) 節炎（CIA）模型。

瑞典Vacara公司開發了一種用軟骨寡聚基質蛋白（COMP）誘導C57BL/6小鼠關(guan) 節炎模型。該蛋能夠在C57BL/6小鼠誘導高發病率的嚴(yan) 重關(guan) 節炎，並伴有強烈的自身抗體(ti) 反應。

關(guan) 鍵詞：瑞典Vacara,類風濕性關(guan) 節炎、軟骨寡聚基質蛋白（COMP）、Cartilage Oligomeric Matrix Protein、C57BL/6小鼠，轉基因

實驗動物：

COMP誘導的關(guan) 節炎可以在雄性和雌性小鼠中都可以進行。如果使用雌性小鼠，應該講它們(men) 放在一起一段時間，以同步它們(men) 的發情周期。如果使用雄性小鼠，特別重要的一點是在性成熟之前將其分組以避免相互攻擊。

在實驗中，所有小鼠必須年齡和性別匹配，隨機分為(wei) 實驗組，實驗組混合在在籠中。用於(yu) 造模的小鼠至少要9周齡。小鼠在標準飼養(yang) 條件下飼養(yang) ，優(you) 先選擇SPF飼養(yang) 設施，該設施具有12小時明暗循環的氣候控製環境，飼養(yang) 在具有標準食物和隨意給水的籠中。實驗也在傳(chuan) 統動物房進行，但是所有的可變條件（感染、通風、光循環、喂養(yang) 等）都需要詳細描述，因為(wei) 這些條件變化可能會(hui) 影響實驗結果。

模型誘導方案：

關(guan) 節炎模型通過COMP 免疫小鼠誘導。將COMP（100ug/小鼠）與(yu) 佐劑（CFA, #263810, BD Difco）或含有結核杆菌（0.5mg/ml）的CFA 1:1 等體(ti) 積混合製備乳劑。製備乳劑最終100ul乳劑中含COMP 100ug。

初次免疫佐劑選擇（CFA或IFA）可能會(hui) 影響疾病的嚴(yan) 重程度。相對含有結核杆菌的（Mycobacterium Tuberculosis H37Ra）IFA,CFA（2mg/ml M.butyricum）會(hui) 導致更嚴(yan) 重的炎症。

不管初次免疫的佐劑如何選擇，預計的發病時間都是相同的。加強免疫後預計出現更嚴(yan) 重的炎症(見圖1)。環境因素如小鼠的微生物菌群變化，可能會(hui) 影響疾病的嚴(yan) 重程度，可以通過選擇適合環境和實驗目的的佐劑來控製。

關(guan) 節炎評分：

初次免疫2周開始，每周至少對小鼠進行三次外周關(guan) 節炎症查看。對爪子關(guan) 節炎的症狀隨機觀察，對每個(ge) 紅腫關(guan) 節進行盲評分。要定義(yi) 為(wei) 臨(lin) 床關(guan) 節炎，必須滿足兩(liang) 個(ge) 標準，即腫脹和發紅。因此，例如在活動性關(guan) 節炎後仍然腫脹但不載觀察到紅斑的爪子不被評分或不認為(wei) 是關(guan) 節炎。

臨(lin) 床關(guan) 節炎的評分結果是0-60分：根據關(guan) 節炎疾病的嚴(yan) 重程度，每隻發炎的足趾或關(guan) 節得1分，腳腕或腳踝發炎得1-5分，每隻爪子得0-15分，每隻小鼠最多得60分。典型的嚴(yan) 重過程如圖1.所示。

圖1COMP誘導C57BL/6小鼠具有高發病率和嚴(yan) 重程度的關(guan) 節炎。小鼠用COMP+CFA佐劑（n=7）或IFA+0.5mg/ml結核杆菌（n=6）免疫，第35天加強免疫。關(guan) 節炎發病率（左側(ce) ）和關(guan) 節炎評分（右側(ce) ）。

COMP誘導的關(guan) 節炎特征：

與(yu) 人關(guan) 節炎相似，COMP誘導的關(guan) 節炎導致關(guan) 節炎關(guan) 節中顯著的滑膜增生、炎症細胞浸潤及軟骨和骨破壞。COMP誘導的關(guan) 節炎導致顯著的抗COMP  IgG, IgG1,IgG2b自身抗體(ti) 反應，與(yu) 初次免疫使用的佐劑無關(guan) 。在C57BL/6小鼠中，未觀察到顯著的抗II型膠原抗體(ti) 反應，這表明COMP特異性B細胞反應。COMP反應似乎是肽特異性的，因為(wei) 很少有肽被認為(wei) 主要的自身抗體(ti) 表位。

COMP僅(jin) 以天然構象誘導嚴(yan) 重的臨(lin) 床關(guan) 節炎。變性的COMP免疫，隻能導致輕微的關(guan) 節炎，發病率低。然而，這良好總構象都誘導抗COMP抗體(ti) 反應，但當天然COMP用於(yu) 免疫時，觀察到更強的抗COMP IgG、IgG1和IgG2b抗體(ti) 反應。結論是：構象表位的抗體(ti) 是致病性的，可以誘導關(guan) 節炎，並且這些抗體(ti) 可能是由COMP特異性細胞協助激發的。

檢測方法：

關(guan) 節炎發生後，可以在蘇木精和伊紅染色後對關(guan) 節炎急性組織學分析。抗COMP的血清抗體(ti) 可以通過ELISA法測定，使用重組人COMP作為(wei) 測定抗原。操作流程，用於(yu) 檢測IgG，IgG1和IgG2b係列抗體(ti) 及在C57BL/6小鼠典型結果在文獻3種有詳細描述。肽特異性T細胞活化可通過體(ti) 外刺激脾細胞並通過ELISpot測定IFN-γ 分泌來測量，如文獻3所述。

優(you) 勢：

COMP在C57BL/6小鼠中誘導的關(guan) 節炎與(yu) 類風濕性關(guan) 節炎小鼠模型CIA有許多相似之處，能夠誘發嚴(yan) 重的多發性關(guan) 節炎。該炎症於(yu) MHCII類分子相關(guan) ，T細胞識別的COMP衍生肽已被證實。與(yu) CIA一樣，T細胞對非自身蛋白抗原的反應促進了關(guan) 節炎的誘導，因為(wei) 免疫優(you) 勢肽不能很好的與(yu) MHC II類分子結合，因此不能誘導耐受性。COMP免疫誘導強烈的抗體(ti) 反應，類似CIA中的II型膠原。

COMP誘導的關(guan) 節炎的主要優(you) 點是：可以在攜帶H-2b單倍型的C57BL/6小鼠中誘導嚴(yan) 重的關(guan) 節炎。C57BL/6小鼠被認為(wei) 是免疫學研究的標準背景，並且大多數轉基因小鼠株都是在這個(ge) 背景下建立的。對於(yu) COMP誘導的關(guan) 節炎，遺傳(chuan) 修飾的C57BL/6小鼠可用於(yu) 關(guan) 節炎實驗，而無需廣泛的回交。

COMP也可以誘導C3H背景表達A^q, A^p小鼠。因此，COMP誘導的關(guan) 節炎在許多小鼠品係中可用於(yu) 研究關(guan) 節炎，並且免疫反應與(yu) 人類RA直接相當。COMP誘導的小鼠關(guan) 節炎在雌性和雄性中都是可誘導的。此外，COMP可以誘導大鼠關(guan) 節炎，與(yu) LEW,E3 或DA 背景的RT1u MHC單倍型相關(guan) 。

局限性：

   COMP誘導的關(guan) 節炎在加強免疫後會(hui) 誘發嚴(yan) 重的關(guan) 節炎，因此需要幾周的時間來實驗。另一方麵，這種特征被認為(wei) 是一種優(you) 勢，因為(wei) 該疾病模型與(yu) 人類風濕性關(guan) 節炎具有相同的免疫特征和T細胞和B細胞依賴性機製。

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